陳 多，張 湜，* ，陳文亮，嚴(yán) 明

(1.南京工業(yè)大學(xué)自動(dòng)化與電氣工程學(xué)院，江蘇南京210000;2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京210000)

鼠李糖苷酶在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，在食品工業(yè)中，其常被用于去除果汁中柚皮甘的苦味［1］。畢赤酵母(Pichia Pastoris)是一種廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工程的真菌。已報(bào)道的利用畢赤酵母進(jìn)行分泌表達(dá)的外源蛋白(recombinant proteins;rprotein)已達(dá)到400 多種［2-3］。經(jīng)過改造的畢赤酵母可以高效的表達(dá)鼠李糖苷酶。畢赤酵母不僅外源蛋白的表達(dá)量高，而且目標(biāo)蛋白的表達(dá)純度也相當(dāng)?shù)母撸?］。畢赤酵母有上述諸多優(yōu)點(diǎn)，但其碳源甲醇具有較強(qiáng)毒性。過高的甲醇濃度不僅會(huì)降低畢赤酵母的表達(dá)效率，更有可能造成菌體的大面積死亡［4］。如何控制甲醇流加速率使得畢赤酵母既能正常分泌外源蛋白又不至于被甲醇?xì)⑺朗悄壳暗膶?shí)際生產(chǎn)中必須面對的問題。目前常用的的甲醇流加方式有:a.、恒速流加;b.、指數(shù)流加［5］;c.、變速流加［6］。方法a 實(shí)現(xiàn)方式簡單，但效率相對較低;方法b 考慮到了菌體的生長特性:指數(shù)生長［7］;方法c 利用反饋控制實(shí)現(xiàn)限制性底物濃度恒定［8］，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，其實(shí)現(xiàn)有很大難度，原因在于很多的中間參數(shù)較難在線測得，如:菌體濃度、底物濃度［9］、呼吸商［10］等等。本文提出一種基于模型的最優(yōu)控制方法。其特點(diǎn)在于:只要有了合理的模型結(jié)構(gòu)，就能求出使得目標(biāo)函數(shù)值最大的控制軌跡。因此，首先需要建立系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模型［5，11］，而后確定目標(biāo)函數(shù)，最后將最優(yōu)控制問題化為微分代數(shù)方程(DAEs)求解問題。事實(shí)證明，此種方法可有效提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

P.Pastoris Invitrogon 公司GS115 Mut + 甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母;培養(yǎng)基 按照文獻(xiàn)［12］配制。

New Brunswick Scientific Bio110 型連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵罐 美國NBS 公司;Eppendorf 5415 R 型冷凍離心機(jī)、Eppendorf BioP plus 型酶標(biāo)儀 德國Eppendorf 公司;UV1700 系列紫外可見分光度儀 上海奧析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

從瓊脂培養(yǎng)基上挑取適量P.Pastoris 菌體接入裝有10mL 種子液培養(yǎng)基的50mL 搖管中，置于30℃，800r/min 搖床中，培養(yǎng)16h。

將搖管中的菌液轉(zhuǎn)接入3 個(gè)配有100mL YPD 培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于30℃，800r/min 搖床中，培養(yǎng)12h。

按照10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接入裝有3L 發(fā)酵液的5L 發(fā)酵罐中。

pH 設(shè)定值5.0，氨水調(diào)節(jié)pH，溫度設(shè)定30℃，融氧設(shè)定值25%并關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)速。

甘油階段24h，甘油采用指數(shù)流加，流加速率為Q =0.39e0.18t(L/h)，甘油流加24h 后，饑餓0.5h。

甲醇誘導(dǎo)時(shí)間為30h。

甲醇流加曲線的實(shí)現(xiàn)在Bio110 型高級發(fā)酵罐配套的 Supervisory Control and Data Acquisition(SCADA)software programs 上實(shí)現(xiàn)。

1.3 檢測方法

誘導(dǎo)過程中每隔2h，取發(fā)酵液10mL，8000r/min冷凍離心機(jī)離心5min，取上清液。

酶標(biāo)儀在600nm 處測定鼠李糖苷酶濃度;利用分光度儀在595nm 處根據(jù)BradFord 法測定總蛋白量。

2 結(jié)果與討論

2.1 最優(yōu)化問題的建立

構(gòu)建以下非線性系統(tǒng)［5，13］:

其中，V 為發(fā)酵罐總體積，CX為菌體濃度，CAOX為啟動(dòng)子AOX1 濃度，CP為目標(biāo)蛋白濃度;μ 為菌體比生長速率:

qAOX為啟動(dòng)子AOX1 比生產(chǎn)速率:

qM為甲醇比消耗速率:

qp為產(chǎn)物比生產(chǎn)速率:

方程參數(shù)見表1。

令V～x1，CX～x2，CAOX～x3，CP～x4，u～x9

構(gòu)造非線性泛函并描述最優(yōu)控制問題如下［13］:

為簡化方程起見，x4(產(chǎn)物濃度)方程忽略蛋白的降解對濃度造成的影響，即令原式(1)中蛋白質(zhì)降解常數(shù)kP為0。

表1 模型參數(shù)Table 1 Model Parameters

根據(jù)泛函求極值及變分法相關(guān)定理構(gòu)建非線性Hamilton 函數(shù)為:

根據(jù)泛函極值存在條件知［13］:

令λ1、λ2、λ3、λ4為x5、x6、x7、x8，得到如下DAEs(微分代數(shù)方程)問題:

此DAE 問題的階數(shù)大于1，直接求解非常困難，故將代數(shù)方程進(jìn)行改寫，提取因子x1，構(gòu)建x9′(即x1″)(x9′結(jié)構(gòu)復(fù)雜，此處略去)。

由此，問題轉(zhuǎn)化為λ 初值選取問題。循環(huán)調(diào)用排列組合表(表2)作為λ 初值，代入ODE45 進(jìn)行求解。λi(i =1，2，3，4)取值范圍為0～10，步長為0.5，編寫程序循環(huán)求解并比較結(jié)果。

2.2 優(yōu)化的甲醇流加軌跡求取

設(shè)置 終 端 時(shí) 間 tf= 30h，運(yùn) 用 Matlab 進(jìn)行ODE45。

表2 部分λ 取值表Table 2 Partial λValue(Full Length:194481 lines in this paper)

分析結(jié)果，x1(tf)x4(tf)的最大值出現(xiàn)在λi(i =1，2，3，4)的初值取(8.5、5、0、10)處，由此所得的甲醇流加曲線如圖1 所示。

圖1 最優(yōu)甲醇流加速率曲線Fig.1 Optimal Curve of methanol

利用Origin 對迭代生成的x9離散值進(jìn)行曲線擬合，R2=0.991。

2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較

分別用三種不同流加方式進(jìn)行上罐實(shí)驗(yàn)，初始流加速率均為0.02L/h。結(jié)果如下:

對比三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(表3)，我們可以看出，恒定流加產(chǎn)量很低;相對于指數(shù)流加，最優(yōu)化算法所得的流加方式使得鼠李糖苷酶產(chǎn)量分別提高了約15%。

圖2 三種流加方式的外源蛋白表達(dá)濃度Fig.2 r-protein concentration of three strategies

表3 三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Three Practice Data

圖3 三種流加策略的外源蛋白表達(dá)量Fig.3 r-protein quantity of three strategies

觀察3 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，第三種方法的產(chǎn)量明顯高于前兩種。

3 結(jié)論

本文提出了一種基于最優(yōu)控制理論來提高P.Pastoris 酵母表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量的方法，此種方法相比于恒定流加和指數(shù)流加都有一定提高。

需要說明的是，此種方法通過循環(huán)模擬不同乘子λ 的迭代求解的結(jié)果不一定是最優(yōu)解，需要補(bǔ)充驗(yàn)證。文中只是給出了乘子λ 一段較小的范圍:0～10。原因在于隨著λ 范圍的增大或者步長的縮小，其運(yùn)算復(fù)雜程度大大提高。想要獲得更優(yōu)的控制曲線，需要更大范圍的乘子運(yùn)算;此外，模型的精確性也會(huì)直接影響到此方法的實(shí)際效果。

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