湯 彬，薛 平，李 祥 ，陳建偉，邱海龍，張奉蘇

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046)

南方紅豆杉別名美麗紅豆杉、紅榧、紅葉水杉、海羅松、矮杉，是中國所特有的紅豆杉科紅豆杉屬植物。國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，其幼嫩枝葉和種子都可作藥用。藥用南方紅豆杉幼嫩枝葉，性味苦，平;民間也有用于治療糖尿病［1］?！吨兴幋筠o典》、《本草綱目》、《中華藥?！分杏涊d:紅豆杉有利尿、通經(jīng)、降血脂作用，對腎病、惡性腫瘤、高血壓、高血脂癥、糖尿病有獨(dú)特療效。近些年對紅豆杉資源的利用主要集中在紫杉烷類物質(zhì)上，對其中其他類活性成分如黃酮類、木質(zhì)素類、糖苷類、酚酸類和多糖等［2-4］研究很少。近年來，大量研究表明，多糖除了有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、消化系統(tǒng)保護(hù)作用的生物學(xué)活性外，還有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、抗凝血等作用［5-7］。東北紅豆杉多糖具有降血糖活性［8］，而對南方紅豆杉多糖的研究很少。本文對南方紅豆杉枝葉中活性多糖進(jìn)行了含量測定，并以HepG2 細(xì)胞和α-葡萄糖苷酶作為體外受體模型，對其體外降血糖活性做了初步的研究，為后續(xù)研究其體內(nèi)降血糖及作用機(jī)制提供一定的研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南方紅豆杉枝葉 購于無錫紅豆集團(tuán)南方紅豆杉種植基地，藥材經(jīng)本院陳建偉教授鑒定為紅豆杉科南方紅豆杉Taxus chinensis var.mairei，飲片標(biāo)本現(xiàn)保存于本校藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室;葡萄糖對照品、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、濃硫酸等其他試劑 國產(chǎn)分析純;HepG2 細(xì)胞 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;含酚紅DMEM 高糖培養(yǎng)基 Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT) Sigma 公司;鹽酸二甲雙胍 上海衡山藥業(yè)有限公司;葡萄糖測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;胰島素 江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;超純水。

紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;酶標(biāo)儀 美國BioTek 公司;倒置相差顯微鏡 日本OLYMPUS 公司;CO2培養(yǎng)箱 日本三洋(SANYO)公司;超純純水儀 南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司;美國Corning-Coastar 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南方紅豆杉粗多糖的提取 稱取干燥的紅豆杉枝葉適量，打粉過10 目篩，混合均勻，第一次加8倍量的水，提取2h，第二次加6 倍量的水，提取1h，兩次提取液合并，3000r/min 離心，保留上清液，減壓濃縮，濃縮液加入95%乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，充分?jǐn)嚢韬箪o置24h，3000r/min 離心15min，棄去濾液。將所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，30℃真空干燥，即得南方紅豆杉粗多糖。

1.2.2 南方紅豆杉多糖的含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.55mg，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得到0.1055mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.2.2 苯酚溶液的制備 稱取重蒸苯酚5.0g，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL 棕色容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得到5%苯酚溶液，備用。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取南方紅豆杉多糖粉末16.68mg，加適量水溶解，室溫下超聲15min，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶中，定容，作為供試品溶液，備用。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9mL 置于10mL 具塞試管中，分別加水補(bǔ)齊至1.0mL，取超純水1.0mL 作為空白對照，加入5%苯酚溶液1.0mL 充分混合后，迅速加入濃硫酸5.0mL，充分混合，室溫放置5min 后置沸水中反應(yīng)15min。取出并迅速插入冰水浴放置10min，于489nm 處測定吸收度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.5 南方紅豆杉藥材中多糖的含量測定 精密吸取供試品溶液1.0mL 置于10mL 具塞試管中，取超純水1.0mL 作為空白對照，按“1.2.2.4”下方法測定，計(jì)算南方紅豆杉藥材中多糖的含量。多糖含量(%)=(CDVW×103)/m ×100%，式中:C 為供試品溶液中葡萄糖的濃度(μg /mL)，D 為稀釋倍數(shù)，V 為供試品溶液的體積(mL)，W 為藥材中粗多糖的得率，m為供試品的質(zhì)量(mg)。

1.2.3 南方紅豆杉粗多糖的體外降血糖活性的測定

1.2.3.1 HepG2 細(xì)胞體外受體模型 HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng):HepG2 細(xì)胞復(fù)蘇后采用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁長滿后，用0.25%胰蛋白酶消化，每3d 1∶3 傳代一次，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞模型的葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)及MTT 實(shí)驗(yàn):按文獻(xiàn)方法［9-10］稍作改進(jìn)，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5 ×104個/mL，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100μL 細(xì)胞懸液。本實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、模型組、二甲雙胍組(終劑量為10-3mol/L)、南方紅豆杉粗多糖組(終劑量分別為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005mg/mL)。待細(xì)胞單層貼壁后，模型組更換新配制的含有胰島素濃度為5 × 10-7mol/L 的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，以造成胰島素抵抗細(xì)胞模型。棄去培養(yǎng)基，給藥組加入不同濃度的不含血清的含藥培養(yǎng)基，正常對照組及模型組則加入不含血清的培養(yǎng)基，各組均包括含生理胰島素組與不含生理胰島素組。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h 后，用葡萄糖臨床試劑盒檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，計(jì)算各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每孔加入5g/LMTT 溶液20μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4h 后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔中的培養(yǎng)基，每孔加入150μLDMSO，振蕩器振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490nm 波長下測定各孔的吸光度值，以檢測細(xì)胞的數(shù)目與活力。

1.2.3.2 α-葡萄糖苷酶體外受體模型 南方紅豆杉粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用:參考文獻(xiàn)［11 -12］的反應(yīng)體系，96 孔板上加磷酸鉀緩沖液(pH6.8)110μL，再加入0.2U/mLα- 葡萄糖 苷 酶20μL，10μL 樣品溶液，混勻，37℃恒溫15min 后，加入2.5mmol/L PNPG 20μL，混勻后37℃恒溫反應(yīng)15min。最后加入80μL 0.2mol/L 的Na2CO3溶液，于405nm 波長下測OD 值。

以阿卡波糖(Acarbose)為陽性對照，同時(shí)設(shè)定對照組(緩沖液+ 酶液+ 底物)，空白組對照組(緩沖液)，樣品測定組(樣品+酶液+底物)，樣品對照組(樣品+ 緩沖液)，陽性對照組(Acarbose + 酶液+底物。

酶活性抑制率= {1- (A樣品- A樣品對照)/(A對照-A空白)}×100

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和吸光度的線性關(guān)系，可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。結(jié)果表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.507～13.563μg/mL 內(nèi)呈良好線性關(guān)系(見圖1)。南方紅豆杉藥材中多糖的含量測定結(jié)果為1.75%。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0mL 置于10mL 具塞試管中，取超純水1.0mL 作為空白對照，按“1.2.2.4”下方法測定，連續(xù)6 次測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RSD 為1.71%，表明該方法具有良好的精確度(見表1)。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)Table 1 Precision of the measured results

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 2 Stability of the measured results

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 3 Reproducibility of the measured results

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 Recovery rate of the measured results

圖1 葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of glucose standard solution

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0mL 置于10mL 具塞試管中，取超純水1.0mL 作為空白對照，按“1.2.2.4”下方法測定，在反應(yīng)結(jié)束后0、5、10、15、30、60、90、120min 測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品溶液在2h 之內(nèi)保持穩(wěn)定(見表2)。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批次干燥的南方紅豆杉枝葉5 份，按“1.2.2.3”和“1.2.2.4”下方法進(jìn)行操作，考察實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性。結(jié)果顯示，RSD 為1.35%，表明該方法重現(xiàn)性較好(見表3)。

2.2.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液0.4mL 置于10mL 具塞試管中，共9 份，依次加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6mL，并添加水使終體積為1.0mL，取超純水1.0mL 作為空白對照，按“1.2.2.4”下方法測定，考察加樣回收率。結(jié)果顯示，平均加樣回收率為97.54%，RSD 為1.60%(表4)，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.3 南方紅豆杉粗多糖的體外降血糖活性

2.3.1 南方紅豆杉粗多糖對胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 南方紅豆杉粗多糖對胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響見表5。

從表5 數(shù)據(jù)得出，南方紅豆杉粗多糖對胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗具有促進(jìn)作用，當(dāng)給藥濃度為0.05mg/mL 時(shí)，效果最佳。同時(shí)，MTT 結(jié)果顯示，所設(shè)的給藥劑量對HepG2 細(xì)胞均具有不同程度的抑制作用，即表示南方紅豆杉粗多糖能促進(jìn)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗并非由于其促進(jìn)細(xì)胞增殖引起的，在扣除MTT 影響時(shí)，南方紅豆杉粗多糖仍表現(xiàn)出較好的促進(jìn)糖消耗作用。

同時(shí)表中數(shù)據(jù)還顯示，建立胰島素抵抗模型后細(xì)胞有增殖，MTT 值大于正?？瞻捉M。而生理胰島素的加入則會促進(jìn)細(xì)胞的輕度增殖，扣除MTT 影響后發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉粗多糖與生理胰島素具有一定的協(xié)同作用。

2.3.2 南方紅豆杉粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影響 南方紅豆杉粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影響見表6。

表6 中的數(shù)據(jù)顯示，南方紅豆杉粗多糖抑制活性較好，抑制率明顯高于陽性對照藥物，且對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有劑量依賴性，對南方紅豆杉粗多糖開發(fā)成α-葡萄糖苷酶抑制劑具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。

表5 南方紅豆杉粗多糖對胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響Table 5 Effect of crude polysaccharides from Taxus chinensis var.mairei to the glucose consumption of insulin-resistance HepG2 cells

表6 南方紅豆杉粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影響Table 6 Effect of crude polysaccharides from Taxus chinensis var.mairei to inhibitory activity of alpha-glucosidase

3 討論

3.1 南方紅豆杉粗多糖對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用

α-葡萄糖苷酶抑制劑可以防治餐后高血糖癥和緩解高胰島素血癥，同時(shí)可以提高糖耐量，具有十分廣闊的應(yīng)用前景?？喙嫌小八幱檬卟恕敝Q，現(xiàn)代研究表明苦瓜中皂苷［13-14］、多糖［15-16］可能是其發(fā)揮降糖作用的主要活性成分，苦瓜皂苷和多糖對α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，其IC50值分別為1.03mg/mL 和10.73mg/mL［17］。茶多糖也顯示較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其α-葡萄糖苷酶IC50值為3.2 g/L［18］。與上述兩種植物比起來，南方紅豆杉粗多糖的IC50值為38.61mg/L 遠(yuǎn)優(yōu)于它們，說明南方紅豆杉粗多糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性較高。

3.2 南方紅豆杉粗多糖對胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量具有促進(jìn)作用

在HepG2 細(xì)胞體外模型中，無論是否加入生理胰島素，南方紅豆杉粗多糖對胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量均具有促進(jìn)作用，加入生理胰島素后更具有協(xié)同加強(qiáng)作用。

4 結(jié)論

從兩種不同的體外降血糖模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步判斷南方紅豆杉粗多糖具有體外降血糖活性，但還存在一些不足，如胰島素抵抗模型的分子機(jī)制、降糖的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。此外，南方紅豆杉粗多糖中成分比較復(fù)雜，含有多糖的同時(shí)還含有蛋白質(zhì)、氨基酸等等，對于除去蛋白質(zhì)后的精多糖降糖活性如何還有待下一步繼續(xù)研究，為后續(xù)的體內(nèi)降血糖實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步開發(fā)打下基礎(chǔ)。

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