耿焱，劉亞楠，付煒，彭娜，潘志國，雷玉梅，蘇磊

·基礎(chǔ)研究·

熱打擊致大鼠腸上皮IEC-6細胞鈣超載損傷的初步研究

耿焱，劉亞楠，付煒，彭娜，潘志國，雷玉梅，蘇磊

目的研究不同程度熱打擊對體外培養(yǎng)大鼠腸黏膜上皮細胞IEC-6的鈣超載及鈣超載相關(guān)的損傷。方法設(shè)置培養(yǎng)IEC-6細胞的溫度梯度，F(xiàn)luo-3Am探針加熒光顯微鏡及流式細胞術(shù)觀察細胞內(nèi)鈣離子水平的改變，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變，考馬斯亮藍染色法觀察細胞骨架變化，CCK-8法觀察細胞活性改變，黏附實驗觀察基底膜黏附性改變。結(jié)果與正常對照組比較，熱打擊組細胞內(nèi)鈣水平上升(P＜0.01)，呈溫度依賴性。熱打擊組細胞形態(tài)變圓，偽足變短，細胞間隙增大，45℃較43℃改變更為明顯?？捡R斯亮藍染色顯示，熱打擊組細胞骨架增粗、紊亂，出現(xiàn)應(yīng)力性纖維，45℃較43℃改變更為明顯。CCK-8法顯示，熱打擊組細胞活性下降(P＜0.01)，呈溫度依賴性?；啄ゐじ綄嶒烇@示，熱打擊組基底膜黏附性顯著下降(P＜0.01)，呈溫度依賴性。結(jié)論熱打擊可造成IEC-6細胞鈣超載，并造成與鈣超載相關(guān)的一系列細胞損傷，熱打擊對于腸黏膜上皮鈣超載的影響及其機制的進一步研究將有助于了解熱射病的發(fā)病機制。

熱打擊；腸黏膜；細胞黏附；細胞骨架

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內(nèi)毒素，熱射病患者血漿中LPS濃度遠高于其常規(guī)致死濃度(1ng/m l)[1]。腸道是體內(nèi)最大的“儲菌庫”和“內(nèi)毒素庫”，正常情況下，腸黏膜上皮細胞具有屏障作用，可防止腸道內(nèi)細菌和內(nèi)毒素侵入血液循環(huán)[2]。已有直接證據(jù)表明，熱應(yīng)激及高強度運動可增加腸道黏膜通透性，促進內(nèi)毒素進入血液循環(huán)，導致內(nèi)毒素血癥，觸發(fā)熱射病[3-4]。然而，熱射病條件下腸道黏膜通透性增高的機制目前尚不清楚。基于此，本研究模擬熱射病情況下腸黏膜上皮細胞所處的病理環(huán)境，研究熱打擊對腸黏膜上皮細胞內(nèi)鈣離子含量的影響，以及與鈣超載相聯(lián)系的細胞形態(tài)、活性、骨架及基底膜黏附性變化，為進一步研究熱打擊條件下腸黏膜上皮細胞病變在腸道細菌和內(nèi)毒素移位中的作用機制提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑 大鼠腸黏膜上皮細胞株IEC-6為南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學實驗室提供，鈣離子濃度檢測試劑Fluo-3Am探針購自美國ENZO公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，人工基底膜matrigel購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) IEC-6細胞復蘇后，1000r/min離心10min，棄上清，用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，10萬U/L青霉素、100mg/L鏈霉素)混勻細胞，轉(zhuǎn)入25m l玻璃培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2濃度及飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日換液，以后根據(jù)細胞生長情況每48～72h更換培養(yǎng)液1次，每周傳代1～2次。

1.2.2實驗分組及檢測指標 細胞按熱打擊處理方式分為3組，分別為：對照組(將細胞置于標準37℃、5%CO 2濃度培養(yǎng)箱中同其余各組等時間培養(yǎng))，43℃熱打擊組(將細胞置于43℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30m in)，45℃熱打擊組(將細胞置于45℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30m in)。熱打擊結(jié)束后，進行下述指標的檢測。

1.2.3細胞內(nèi)鈣離子水平檢測 各組按實驗設(shè)計給予相應(yīng)刺激后，更換無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，加入fluo-3Am探針(濃度1μmol/L)，置于標準37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中避光孵育60m in進行熒光探針裝載，分別進行熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測熒光強度，代表細胞內(nèi)鈣離子水平。熒光顯微鏡檢查方法：用D-Hank's液漂洗3次，再加入適量D-Hank's液，避光孵育15m in；確定Fluo-3Am在細胞內(nèi)完全轉(zhuǎn)變成Fluo-3后進行熒光顯微鏡檢測。流式細胞儀檢測方法：棄上清，用2.5g/L胰蛋白酶消化貼壁細胞后，用D-Hank's液制備成單細胞懸液，進行流式細胞儀檢測。每個獨立實驗均重復3次。

1.2.4CCK-8法檢測細胞活性 取對數(shù)生長期細胞，按5×105個/孔鋪入可拆卸96孔板，培養(yǎng)24h后，更換無血清高糖DMEM(100μl/孔)培養(yǎng)過夜，按實驗分組進行相應(yīng)刺激，每組設(shè)4個復孔。刺激完畢，更換培養(yǎng)上清為無血清高糖DMEM(90μl/孔)，加入10μl CCK-8，置于標準37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm處讀取光密度(A)值，計算細胞活性，細胞活性=實驗組A值/對照組A值×100%。每個獨立實驗均重復3次。

1.2.5細胞基底膜黏附實驗 1×PBS配制10μg/m l matrigel溶液，于96孔板中每孔加入75μl，置37℃鋪板1h；1×PBS配制10g/L BSA，煮沸13min變性，每孔加100μl封閉1h；用1×PBS沖洗2次。取對數(shù)生長期細胞，無血清高糖DMEM培養(yǎng)過夜，按實驗分組進行相應(yīng)刺激；用2.5g/L胰蛋白酶消化細胞，1×PBS洗滌，800r/m in離心5m in沉淀，棄上清；將細胞重懸于含氯化鈣1mmol/L、氯化鎂1mmol/L、氯化錳0.2mmol/L及5g/L BSA的高糖DMEM中，調(diào)整細胞濃度為1×108/L；按100μl/孔加入細胞懸液，每組設(shè)4個復孔，37℃溫育1h。取出96孔板，1×PBS沖洗3次；每孔加入90μl無血清高糖DMEM和10μl CCK-8，置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中孵育2h；采用酶聯(lián)免疫檢測儀讀取450nm處A值，代表每孔的細胞數(shù)。每個獨立實驗均重復3次。

1.2.6細胞骨架染色 細胞占爬片面積40%時，按分組給予相應(yīng)刺激，棄上清，1×PBS沖洗2次；1.5% TritonX-100震蕩洗滌，8m in×3次；M緩沖液(含60mmol/L咪唑、50mmol/L KCl、0.5mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、0.1mmol/L EDTA、lmmol/ L巰基乙醇，pH 7.2)震蕩洗滌，4min×3次；3%戊二醛固定10m in；M緩沖液清洗，3m in×3次；0.2%考馬斯亮藍R250染色40m in；ddH2O充分洗滌，烤干脫水；二甲苯透明，5m in×2次；中性樹膠封固，加蓋玻片封固，置于1000倍高倍鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料以表示，在方差齊性基礎(chǔ)上應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間進一步兩兩比較采用LSD-t法進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1熱打擊對IEC-6細胞內(nèi)鈣離子含量的影響 梯度熱打擊后，裝載鈣離子探針Fluo-3Am，熒光顯微鏡觀察顯示，從對照組、43℃熱打擊組到45℃熱打擊組，熒光強度逐漸增強，表明細胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸升高(圖1A)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組Fluo-3熒光強度為1.75±0.21，43℃熱打擊組為2.02±0.34，45℃熱打擊組為2.75±0.52(圖1B，P＜0.01)，即熱打擊可導致IEC-6細胞內(nèi)鈣離子水平升高，且呈溫度依賴性。

圖1 梯度熱打擊對IEC-6細胞內(nèi)鈣含量的影響Fig.1 Effect of gradient heat stress on intracellular Ca2+ concentration of IEC-6 cells

2.2熱打擊對IEC-6細胞形態(tài)及活性的影響 光鏡下觀察，與對照組相比，43℃和45℃熱打擊30m in均可使細胞輪廓變圓，偽足變短，細胞間隙增大，以45℃最為明顯(圖2A)。CCK-8試驗顯示，與對照組對比，熱打擊組IEC-6細胞活性均顯著下降(P＜0.01)，同時，45℃組細胞活性較43℃組顯著下降(圖2C，P＜0.01)。

2.3熱打擊對IEC-6細胞骨架的影響 不同程度熱打擊后，相差顯微鏡高倍鏡(1000×)下可見，對照組細胞骨架分布均勻，熱打擊后細胞骨架發(fā)生重組，細胞周邊骨架減少，細胞內(nèi)出現(xiàn)應(yīng)力纖維，細胞骨架增粗、紊亂，排列呈明顯的非極性單向分布，45℃熱打擊組上述現(xiàn)象更為明顯(圖2B)。

2.4熱打擊對IEC-6細胞基底膜黏附性的影響 如圖2D所示，與對照組相比，43℃和45℃熱打擊組細胞基底膜黏附性均顯著下降(P＜0.01)，與43℃比較，45℃熱打擊組細胞基底膜黏附性下降更為明顯(P＜0.01)。

3 討 論

熱射病是一種繼發(fā)于熱損傷后的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(system ic inflammatory response syndrome，SIRS)，進而發(fā)展為膿毒癥(sepsis)，引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的過程[5-6]，目前認為腸黏膜的通透性增高在此過程中起重要作用。腸黏膜通透性增高會導致大量LPS進入門脈循環(huán)，超過肝臟及免疫系統(tǒng)的清除能力而進入體循環(huán)，產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥，導致急性炎癥性反應(yīng)，進而引起壞死、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、MODS以及其他常見的熱射病癥狀[7]。

腸道是MODS的樞紐器官，是炎癥介質(zhì)的擴增器[8]。腸黏膜屏障主要由機械性屏障、生物學屏障和免疫屏障組成，其中最重要的是機械性屏障，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是腸上皮細胞的完整性及其相鄰腸上皮細胞間的連接[9]。腸上皮細胞需黏附于細胞外基質(zhì)才能生長，稱為錨著依賴型細胞。如果細胞從黏附的基質(zhì)處脫落即會激活自殺性程序，破壞腸黏膜屏障的完整性[10]。正常情況下，完整的上皮細胞和基底膜間的黏附結(jié)構(gòu)為基底膜-整合素-細胞骨架[11]。細胞內(nèi)鈣超載是整合素改變的始動因素，鈣通道阻斷劑可以抑制整合素的分布變化[12]。細胞骨架蛋白是鈣超載的主要作用靶點，已有大量研究證實鈣超載可導致細胞骨架破壞，而細胞骨架蛋白在細胞黏附中發(fā)揮著重要作用，細胞骨架結(jié)構(gòu)的破壞可以影響整合素的分布、表達及信號傳導，并導致細胞黏附性減弱，引起細胞脫落，破壞腸黏膜屏障的完整性，促進腸道細菌和內(nèi)毒素移位[13]。目前已有較多關(guān)于在缺血缺氧等情況下腸上皮細胞發(fā)生鈣超載，以及鈣超載對于腸上皮細胞損傷的研究報道，但對于熱射病條件下腸黏膜上皮細胞內(nèi)鈣含量的變化，及其與腸上皮細胞損傷的關(guān)系，尚無切實可靠的實驗依據(jù)。

圖2 熱打擊對IEC-6細胞的損傷Fig.2 Impairment of IEC-6 cells by heat stress

根據(jù)本研究結(jié)果，熱打擊可以導致IEC-6細胞內(nèi)鈣超載，且呈溫度依賴性。與IEC-6細胞內(nèi)鈣超載水平相對應(yīng)的，IEC-6細胞形態(tài)和活性也發(fā)生改變，表現(xiàn)為細胞輪廓變圓，偽足變短、變粗，細胞間隙變大，細胞活性下降，鈣超載水平高的IEC-6細胞，上述形態(tài)改變更為明顯。熱打擊對于IEC-6細胞骨架和基底膜黏附性影響的實驗結(jié)果也有類似現(xiàn)象，鈣超載水平高的IEC-6細胞，其細胞骨架改變更為明顯，表現(xiàn)為細胞骨架增粗、紊亂，細胞周邊骨架減少，應(yīng)力纖維出現(xiàn)，同時基底膜黏附性更低。目前對于鈣超載引起細胞骨架改變的機制還不是十分清楚，Kuhne等[14]報道鈣超載可以通過激活gelsolin對內(nèi)皮細胞肌動蛋白產(chǎn)生切割破壞，而Kulkami等[15]報道細胞內(nèi)鈣超載可以通過激活calpain水解F-actin及talin、α-actin等結(jié)合蛋白。IEC-6細胞鈣超載水平與細胞形態(tài)、活性、細胞骨架及基底膜黏附性改變的對應(yīng)關(guān)系的存在，也從另一個側(cè)面證明了在熱打擊條件下，IEC-6細胞內(nèi)鈣超載的存在。目前對于熱打擊導致細胞鈣超載的機制尚不清楚，有研究認為可能是鈣離子通道及細胞膜通透性所致，但具體機制仍需進一步探索研究。

綜上所述，本實驗結(jié)果初步證明，熱打擊可以造成腸黏膜上皮細胞鈣超載，并呈溫度依賴性，在細胞內(nèi)鈣超載的同時，細胞形態(tài)、活力、細胞骨架和基底膜黏附性均發(fā)生了相應(yīng)改變，這為理解熱射病發(fā)生發(fā)展過程中，腸黏膜屏障通透性增加，進而引發(fā)腸道細菌和內(nèi)毒素移位的作用機制提供了直觀的實驗依據(jù)，對其機制的進一步研究，將有助于了解熱射病發(fā)生及發(fā)展的機制。

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Calcium overload injury of rats’ enterocy te IEC-6 by heat stress in vitro

GENG Yan1, LIU Ya-nan2, FU Wei2, PENG Na1, PAN Zhi-guo1, LEI Yu-mei3, SU Lei1*
1Department of ICU, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command, Guangzhou 510010, China
2Postgraduate School of Nanfang Medical University, Guangzhou 510515, China
3Department of Emergency, 157 Hospital of PLA, Affiliated Hospital of Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command,Guangzhou 510515, China
*

, E-mail: gytools@sina.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81071529, 81101406), and Postdoctoral Foundationof China (2012M512181)

ObjectiveTo investigate the effect of gradient heat stress on calcium overload of rats' enterocyte IEC-6 and calcium overload-related cell injuryinvitro.MethodsThermal gradient was set in culturing IEC-6 cellsinvitro. After thermal stimulation, Fluo-3Am probe with fluorescence microscope or flow cytometry was used to detect the change in intracellular Ca2+concentration of IEC-6 cells. Phase contrast microscope was used to observe the morphological change in IEC-6. Coomassie blue dying method was employed to test the change in IEC-6 cytoskeleton. CCK-8 assay was used to assess cellular viability. Adhesion assay was applied to test the change in basilar membrane adhesiveness of IEC-6 cells.ResultsCompared with normal control group, cells of heat stress groups showed a thermal-dependent increase in intracellular Ca2+concentration (P＜0.01). Cells of heat stress groups were rounded in shape, the pseudopod was shorter, and cell space was enlarged. These phenomena were more obvious in 45℃ culture than in that of 43℃. Coomassie blue dying showed that the cytoskeleton of cells in heat stress groups became thickened and disordered, and stress fibers appeared. These phenomena were also more obvious in 45℃ culture than in that of 43℃. A thermal-dependant decline of cell viability in heat stress groups was observedviaCCK-8 assay (P＜0.01), and a thermal-dependant decline of basilar membrane adhesiveness in heat stress groups was observedviaadhesion assay (P＜0.01).ConclusionHeat stress may cause calcium overload of IEC-6 cells, and thus resulting in a series of calcium overload-related cell injury. Further investigation of the effect and mechanism of heat stress on calcium overload of intestinal mucosa endothelial cells may help further understand the mechanism of the pathogenesis of heat stroke.

heat stress; intestinal mucosa; cell adhesion; cytoskeleton

R594.12

A

0577-7402(2013)07-0535-05

2012-12-26；

2013-05-17)

(責任編輯：熊曉然)

國家自然科學基金(81071529，81101406)；中國博士后科學基金(2012M 512181)

耿焱，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師。主要從事重癥中暑診治方面的研究

510010 廣州 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學科(耿焱、彭娜、潘志國、蘇磊)；510515 南方醫(yī)科大學研究生學院(劉亞楠、付煒)；510515 廣州 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院附屬157醫(yī)院急診科(雷玉梅)

蘇磊，E-mail: gytools@sina.com