陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科（西安710068） 朱舜明 官功昌 程 功 趙 欣 朱火蘭

胰島素抵抗（IR）不僅是2型糖尿病發(fā)病的重要病理生理機(jī)制，也是中心性肥胖、糖代謝異常、脂代謝紊亂（高甘油三酯血癥和／或高密度脂蛋白降低）、微量白蛋白尿、高血壓、冠心病等疾病的共同土壤。胰島素抵抗已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。研究以3T3－L1前脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)TNF－α誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，從而建立胰島素抵抗細(xì)胞模型。

材料與方法

1 材 料 細(xì)胞3T3－L1前脂肪細(xì)胞系購(gòu)自ATCC（American Type Culture Collection）。試 劑DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、胰島素（INS）、腫瘤壞死因子α（TNF－α）、cytochalasin B、牛血清蛋白購(gòu)自 Sigma－Aldrich公司。3H－2－DG 購(gòu) 自 GE 公 司 公司。油紅 O、BCA蛋白分析試劑盒、Triton X－100購(gòu)自鼎國(guó)公司。膜蛋白提取試劑盒購(gòu)自Bestbio公司。PPO、POPOP購(gòu)自上海化學(xué)試劑廠。二氧化碳孵箱，Thermo公司；LS 6500液態(tài)閃爍儀，Beckman公司；酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司；熒光倒置顯微鏡，奧林巴斯公司。

2 方 法 ①3T3－L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化：3T3－L1前脂肪細(xì)胞用高糖DMEM（含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素）作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞產(chǎn)生接觸抑制后傳代，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度并接種于12孔培養(yǎng)板中。數(shù)天后，細(xì)胞產(chǎn)生接觸抑制，2d后更換培養(yǎng)基為高糖DMEM 培養(yǎng)基，其中含有IBMX（0．5mM）IBMX（0．5mM）、地塞米松（1μM）和胰島素（10μg／ml）。再過(guò)2d后，培養(yǎng)基更換為只含有10%胎牛血清和胰島素（10μg／ml）。再過(guò)兩天后，更換培養(yǎng)基為普通高糖DMEM培養(yǎng)基。8～12d后，大部分細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。觀察細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化。②油紅O染色鑒定成熟脂肪細(xì)胞：用異丙醇溶解油紅O。將成熟3T3－L1脂肪細(xì)胞用冷丙酮固定。洗滌后向12孔板中每孔加入終濃度為0．3g／100ml的油紅O工作液約350ml，在室溫下染色約2h。洗滌后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及染色。③TNF－α誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗：分化成熟的脂肪細(xì)胞在無(wú)血清，含有0．5% （w／v）牛血清白蛋白的高糖 DMEM中培養(yǎng)3h。將成熟脂肪細(xì)胞分為對(duì)照組、1μM TNF－α組、10μM TNF－α組、和 100μM TNF－α組，每組 24孔。3h后，3組TNF－α處理細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h；對(duì)照組細(xì)胞更換為僅含10%胎牛血清的高糖DMEM。24h后，更換培養(yǎng)基為含有100nM胰島素和10%胎牛血清的高糖DMEM繼續(xù)作用30min。分別收集對(duì)照組和TNF－α處理組細(xì)胞，進(jìn)行葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)鑒定是否成功建立胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型。④3H葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)：將各組細(xì)胞用KRP緩沖液振蕩洗滌。以1μCi／ml為終濃度將含有3H－2－DG的DMEM培養(yǎng)液加入到12孔板。10min后，用冰KRP緩沖液洗滌，終止反應(yīng)。再用0．1NNaOH溶解細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入到液態(tài)閃爍液中，用液閃儀檢測(cè)每分鐘衰變（DPM）。加入100nM cytochalasin B去除非特異性葡萄糖攝取。將測(cè)得的DPM值減去100nM cytochalasin B處理的DPM值即為該組細(xì)胞葡萄糖攝取的DPM值。通過(guò)BCA蛋白試劑盒測(cè)定每孔細(xì)胞懸液蛋白含量，單位蛋白所攝取的DPM即可通過(guò)蛋白含量可算出，單位為nmol 2－DOG／mg protein／min。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Prism5．0軟件。采用t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IBMX、地塞米松和胰島素能誘導(dǎo)3T3－L1前脂肪細(xì)胞成為成熟脂肪細(xì)胞 體外培養(yǎng)的3T3－L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化前細(xì)胞呈梭形，胞漿中無(wú)脂滴，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣的前脂肪細(xì)胞形態(tài)。融合后，細(xì)胞處于生長(zhǎng)停滯期，細(xì)胞不再繼續(xù)分裂（圖1）。加入IBMX、地塞米松和胰島素誘導(dǎo)劑作用12d后，細(xì)胞變大，變圓，可見(jiàn)脂滴積累，形成典型的“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)（圖2）。經(jīng)油紅O染色鑒定為成熟脂肪細(xì)胞（圖3）。用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2 10μM TNF－α能顯著降低3T3－L1脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性 將誘導(dǎo)成功的成熟脂肪細(xì)胞經(jīng)不同劑量TNF－α作用后，加入100nM胰島素進(jìn)行刺激，通過(guò)3H葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞的葡萄糖攝取。發(fā)現(xiàn)：1μM、10μM 及100μM TNF－α都能使胰島素刺激的葡萄糖攝取下降，其中10μM TNF－α的作用效果最為顯著（P＜0．05）（圖4）。

圖4 與對(duì)照組相比，10μM TNF－α能顯著降低胰島素刺激的葡萄糖攝取

討 論

胰島素抵抗（IR）是指機(jī)體或細(xì)胞對(duì)胰島素不敏感的一種狀態(tài)，也就是指：胰島素作用的靶器官，主要包括骨骼肌，脂肪及肝臟，對(duì)胰島素的敏感性和（或）反應(yīng)性降低。IR不僅是2型糖尿?。═2DM）發(fā)病的重要病理生理機(jī)制，也是機(jī)體發(fā)生代謝綜合征（MS）的核心機(jī)制。作為胰島素在外周重要的靶器官之一，脂肪細(xì)胞也成為體外研究胰島素抵抗的常用細(xì)胞模型。

TNF－α具有廣泛生物學(xué)功能。雖然TNF－α通過(guò)活化巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞具有間接的抗腫瘤活性以及抗感染的重要作用，但如持續(xù)釋放或釋放過(guò)多或與其它細(xì)胞因子關(guān)系失調(diào)，又會(huì)引起機(jī)體的發(fā)熱等，而參與疾病的發(fā)病機(jī)制。TNF－α可由多種組織細(xì)胞產(chǎn)生，其中脂肪細(xì)胞是其重要來(lái)源。研究證實(shí)，TNF－αmRNA在2型糖尿病患者脂肪組織中高表達(dá)，這些患者血漿TNF－α水平也明顯升高。在肥胖或糖尿病小鼠脂肪組織中，TNF－αmRNA也是高表達(dá)。提示TNF－α可能與胰島素抵抗密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，TNF－α對(duì)胰島素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)起著重要作用。TNF－α通過(guò)抑制肌肉、脂肪細(xì)胞胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，使PI3K表達(dá)下調(diào)，影響下游GLUT4蛋白的表達(dá)與向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，進(jìn)而導(dǎo)致IR［1］。此外［2］，TNF－α還能通過(guò)激活核因子κβ抑制物激酶（IKK）β，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等多種途徑誘發(fā)IR。

3 T3－L1細(xì)胞為源于Swiss小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系，將其誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞的方案是目前較為理想的方案之一。該方案可避免原代脂肪細(xì)胞取材不易、純度不一、生存能力差及實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。目前構(gòu)建胰島素抵抗模型多采用高糖高胰島素、地塞米松、游離脂肪酸等［3］藥物與細(xì)胞共孵育。本實(shí)驗(yàn)采用TNF－α作為誘導(dǎo)劑，是為了模擬機(jī)體胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下輕度炎癥的狀態(tài)。采用細(xì)胞水平評(píng)價(jià)胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)：3H葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)作為主要方法，證實(shí)TNF－α能顯著降低胰島素刺激的葡萄糖攝取，從而使成熟脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。該方法簡(jiǎn)便易行、數(shù)據(jù)可靠、重復(fù)性好，為研究胰島素抵抗提供了可靠的細(xì)胞模型。

［1］ Valverde AM，Benito M，Lorenzo M．The brown adipose cell：a model for understanding the molecular mechanisms of insulin resistance［J］．Acta Physiol Scand，2005，138：59－73．

［2］ Mlinar B，Marc J，Janez A，et al．Molecular mechanisms of insulin resistance and associated diseases［J］．Clin Chim Acta，2007，375：20－35．

［3］ Dandona P．Insulin resistance and endothelial dysfunction in atherosclerosis：implications and interventions［J］．Diabetes Technol Ther，2002，4（6）：809－815．