西安體育學(xué)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)教研室（西安710068） 張葆欣 劉遠(yuǎn)新 苗常青

研究表明，HDAC2（組蛋白脫乙酰基酶2）是學(xué)習(xí)和記憶功能的負(fù)調(diào)控因子，研究用小鼠基因獲得或缺失功能模型具體闡明了HDAC2的抑制記憶形成。HDAC2在腦部的過表達(dá)能減少樹突棘和神經(jīng)元的密度、突觸數(shù)及突觸可塑性，相反如果腦部的HDAC2缺乏能導(dǎo)致突觸的數(shù)量增加，從而促進(jìn)記憶形成［1］。HDAC2是1996年首先由Yang等［2］從人的Hela細(xì)胞cDNA文庫篩選得到的，它與另外2個哺乳動物的組蛋白脫乙?；窰DAC1和HDAC3具有相似的結(jié)構(gòu)和某些相同的功能，屬于同一家族。它們共同存在于細(xì)胞中，但各個組蛋白脫乙?；敢灿衅洳煌墓δ?。HDAC2被認(rèn)為與在神經(jīng)可塑性及記憶中所涉及的基因相關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)采取10d游泳運(yùn)動建立動物的疲勞模型［3］，通過避暗穿梭法檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損情況，同時檢測大鼠大腦皮層、海馬CA1區(qū)內(nèi)HDAC2蛋白表達(dá)，從而為闡明運(yùn)動性疲勞所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選用2月齡成年雄性SD大鼠24只，體重200～250g，SPF級，活動能力相近，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。購入后隨機(jī)分為3組，正常對照組（NC）、運(yùn)動后疲勞即刻組（FC）和運(yùn)動疲勞后恢復(fù)90min組（FR）。動物房由固定的專門人員進(jìn)行飼養(yǎng)，室溫控制在20℃～25℃，濕度40%～60%。自然節(jié)律采光，均喂飼普通飼料，自由飲水和進(jìn)食。

2 大鼠運(yùn)動性疲勞模型的建立 購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后通過游泳訓(xùn)練的方式建立SD大鼠的運(yùn)動性疲勞模型。NC組大鼠不進(jìn)行任何的游泳訓(xùn)練，運(yùn)動組動物在建模型之前先適應(yīng)性游泳3d。訓(xùn)練在120cm×65cm×85cm大游泳桶中進(jìn)行，保持水深80cm，水溫（24±2）℃，每天1次訓(xùn)練，每次約20min。3d適應(yīng)性訓(xùn)練后開始建立10d正式訓(xùn)練，前7d每天1次訓(xùn)練，持續(xù)3h；最后2d每天2次訓(xùn)練，2次訓(xùn)練間隔6h。建模期間要時刻觀察大鼠體重、活動狀態(tài)及運(yùn)動能力的變化以準(zhǔn)確判斷疲勞的程度。

3 避暗穿梭實(shí)驗(yàn) 采用避暗穿梭測試儀，將大鼠放在明暗對比明顯兩個相通的箱室（有隔板分開）時。當(dāng)大鼠在明箱適應(yīng)30s后人為的打開通道，一進(jìn)入暗箱時立刻施加電擊從而獲得記憶。24h后再將大鼠放入明箱，記錄從放入明箱到第一次鉆洞進(jìn)入暗箱的時間即潛伏期，同時記錄其進(jìn)入暗箱的錯誤次數(shù)。以300s的時間為限，若300s內(nèi)不進(jìn)入暗箱則該大鼠的記憶保持良好。同時24h后檢測首次進(jìn)入暗室的時間（潛伏期）和進(jìn)入暗室的次數(shù)（錯誤次數(shù)），以評價大鼠的記憶能力。

4 HDAC2蛋白的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 采用腹腔麻醉（巴比妥鈉）大鼠，經(jīng)心臟快速灌注沖洗約250ml生理鹽水，選用4%多聚甲醛約500ml（PBS配制，pH7．4）進(jìn)行灌注沖洗固定，然后取全腦經(jīng)4%多聚甲醛進(jìn)行后固定約20h，再進(jìn)行脫水、包埋、切片，按照HDAC2蛋白免疫組化染色試劑盒說明采用SABC法進(jìn)行染色操作。

5 統(tǒng)計學(xué)分析 分析選用Olympus顯微鏡與計算機(jī)影像系統(tǒng)相結(jié)合，從每只大鼠腦片中隨機(jī)選取5張，同時在大腦皮層和海馬CA1區(qū)各選5個視野分別對各組染色切片中HDAC2蛋白陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，于各個視野下計算陽性細(xì)胞的積分光密度（IOD）值，并取5個視野下的IOD之和。獲取數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS16．0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行單因素方差分析，方差不齊時用秩和檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 大鼠的一般情況 10d的疲勞模型成功建立后NC組表現(xiàn)為體重增長，活動狀況良好。FC、FR組多數(shù)大鼠出現(xiàn)精神不佳，體重增長慢，活動及覓食減少，毛發(fā)無光澤等狀況。

2 避暗穿梭實(shí)驗(yàn) 見表1。FC組與NC組相比，大鼠避暗潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。FR組避暗潛伏期和錯誤次數(shù)較FC組有所恢復(fù)，但與NC組相比仍有顯著差異。表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計的運(yùn)動性疲勞致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型基本建立成功。

表1 不同組別大鼠避暗穿梭實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝8，±s）

表1 不同組別大鼠避暗穿梭實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝8，±s）

注：與NC組相比＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

組 別 n 避暗潛伏期（s） 錯誤次數(shù)（次）8 215．5±23．5 2．1±0．3 FC組 8 64．3±8．5＊＊ 8．5±2．1＊FR組 8 109．7±8．3＊＊ 6．9±0．8 NC組＊

3 腦內(nèi)HDAC2免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)與分布

見表2。HDAC2在大鼠的大腦皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞的胞核均有表達(dá)。NC組大鼠大腦皮層和海馬HDAC2蛋白胞核著色淡；FC組和FR組大鼠的大腦皮層及海馬HDAC2蛋白表達(dá)與NC組比明顯上調(diào)且有顯著性差異，胞核的著色較深，呈棕黃或棕褐色。

表2 不同組別大鼠大腦皮層及海馬HDAC2蛋白免疫組化結(jié)果（±s）

表2 不同組別大鼠大腦皮層及海馬HDAC2蛋白免疫組化結(jié)果（±s）

注：與NC組相比＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

組44．0±5．5 45．0±4．1 FC組 75．2±4．5＊ 76．7±6．5＊FR組 60．7±4．0＊＊ 63．1±5．9大腦皮層 海馬NC組別＊

討 論

研究顯示HDAC2主要位于細(xì)胞核內(nèi)，是聯(lián)系健康和疾病的一個關(guān)鍵因素，在胚胎的發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用，是影響免疫反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子信號，在實(shí)體瘤中常常呈過表達(dá)趨勢［4］。同時HDAC2在成熟的神經(jīng)元突觸傳遞中也起著重要的作用［5－6］。近年來關(guān)于HDAC2與學(xué)習(xí)記憶功能的研究越來越多，HDAC2對學(xué)習(xí)與記憶的功能可能起負(fù)調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示FC組大鼠避暗潛伏期縮短，錯誤次數(shù)出現(xiàn)相應(yīng)增加，同NC組相比差異顯著；而FR組大鼠避暗潛伏期、錯誤次數(shù)與FC組相比均有所恢復(fù)，但與NC組相比差異仍顯著。提示運(yùn)動性疲勞可能明顯損害SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

本實(shí)驗(yàn)取材部位均是參與學(xué)習(xí)記憶功能的重要腦區(qū)（大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FC組大腦皮層及海馬CA1區(qū)內(nèi)的HDAC2表達(dá)顯著上調(diào)，F(xiàn)R組HDAC2表達(dá)水平較疲勞后即刻有所恢復(fù)，但與NC組相比仍有顯著差異，提示運(yùn)動性疲勞后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力可能出現(xiàn)顯著下降。疲勞即刻和恢復(fù)90min組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能均有不同程度的損傷，而HDAC2表達(dá)上調(diào)可能是其損害學(xué)習(xí)記憶功能的重要突觸機(jī)制之一，且這種損害作用在短期內(nèi)得不到很好的恢復(fù)。由此我們可以推斷運(yùn)動性疲勞致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷可能與大鼠大腦皮層和海馬內(nèi)HDAC2蛋白的表達(dá)變化相關(guān)，其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究闡明。

［1］ Guan JS，Haggarty SJ，Giacometti E，et al．HDAC2negatively regulates memory formation and synaptic plasticity［J］．Nature，2009，459（7243）：55－60．

［2］ Yang WM，Inouye C，Zeng YY，et al．Transcriptional repression by YY1is mediated by interaction with a mammalian homolog of the teast global regulator RPD3［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：12845－12850．

［3］ 侯莉娟，劉曉莉，喬德才．大鼠游泳運(yùn)動疲勞模型建立的研究［J］．實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理，2005，22（1）：1－3．

［4］ Kramer OH．HDAC2：a critical factor in health and disease［J］．Trends Pharmacol Sci，2009，30（12）：647－655．

［5］ Montgomery RL，Hsieh J，Barbosa AC，et al．Histone deacetylases 1and 2control the progression of neural precursors to neurons during brain development［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（19）：7876－7881．

［6］ Akhtar MW，Raingo J，Nelson ED，et al．Histone deacetylases 1and 2form a developmental switch that controls excitatory synapse maturation and function［J］．J Neurosci，2009，29（25）：8288－8297．