大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（大連116600） 董 爽 金 華 袁玉姣 蔣 革

腹腔粘連是腹部外科手術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，常導(dǎo)致腹部不適或持續(xù)疼痛、粘連性腸梗阻和不孕癥等并發(fā)癥，給患者帶來極大的痛苦和經(jīng)濟(jì)損失［1］。粘連現(xiàn)象的形成主要是纖維蛋白的沉積超過纖維蛋白的溶解，在此過程中受多種生長因子和細(xì)胞因子參與調(diào)控，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF－β1）和腫瘤壞死因子α（TNF－α）的影響較大［2］。本研究觀察透明質(zhì)酸（HA）與羥乙基淀粉（HES）混合制備的新型防粘連劑對(duì)術(shù)后大鼠腹腔粘連的預(yù)防作用，并利用HE染色和免疫組化的方法觀察粘連局部的TGF－β1和TNFα表達(dá)情況，并對(duì)HA－HES新型防粘連劑的防粘連機(jī)理進(jìn)行探討。

對(duì)象與方法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 體重200±20g的健康雄性SD大鼠20只，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（遼）2008－0002。

2 主要試劑及儀器 ①主要試劑：兔抗鼠多克隆TGF－β1抗體與兔抗鼠多克隆 TNF－a抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒及HE染色試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)公司。1×PBS緩沖液（pH7．2～7．4）購自上海生工生物工程有限公司。透明質(zhì)酸與羧甲基纖維素（HA－CMC）防粘連劑（Guardix－sol）購自韓國韓美藥品株式會(huì)社。②主要儀器：滑動(dòng)切片機(jī)（金華市蓋迪醫(yī)療設(shè)備廠，YD202A）、烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG－9147A）、顯微鏡（NOVEL，N－800M）、冰箱（新飛 BCD－248EMC）、多功能生物顯微 鏡 （OLYMPUS BX51）、 微 波 爐 （Midea MM721NH1－PW）等。

3 實(shí)驗(yàn)方法 ①腹腔內(nèi)粘連程度情況觀察及評(píng)級(jí)：健康的雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分成4組：假性粘連組（5只）、生理鹽水對(duì)照組（5只）、HA－CMC對(duì)照組（5只）和HA－HES實(shí)驗(yàn)組（5只）。麻醉后，開腹，找出盲腸部分，用干紗布反復(fù)輕輕擦拭至腸漿膜層受損面積為1．2cm×1．2cm，表現(xiàn)為表面有針尖大血點(diǎn)，紗布上出現(xiàn)淡紅色。在損傷部位正對(duì)面的腹腔壁用手術(shù)刀做損傷一樣大的面積。用手術(shù)線把離盲腸損傷部位1cm的兩處與腹腔壁損傷部位對(duì)稱的固定，以防止運(yùn)動(dòng)摩擦帶來的影響，促進(jìn)粘連發(fā)生。假性粘連組不做任何處理，對(duì)生理鹽水對(duì)照組、HA－CMC對(duì)照組和HA－HES實(shí)驗(yàn)組粘連部位分別注入0．9%生理鹽水、HA－CMC防粘連劑、HA－HES防粘連劑5ml，關(guān)腹。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，均禁食10h，飼養(yǎng)飼料均為同一種大鼠飼料，手術(shù)7d后解剖觀察各實(shí)驗(yàn)組的腹膜粘連情況。腹腔粘連程度分類標(biāo)準(zhǔn)：參考Phillips 5級(jí)分類法［3］。②HE染色：手術(shù)7d后解剖觀察各實(shí)驗(yàn)組的腹膜粘連情況，同時(shí)將粘連組織銳性切除，包括腹膜及粘連相關(guān)組織。標(biāo)本行4μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行 HE染色［4］，光鏡下觀察各組織形態(tài)學(xué)變化。③免疫組織化學(xué)檢測：TGF－β1和TNF－α免疫組織化學(xué)染色參照試劑盒說明書操作。用正常羊血清替代一抗做陰性對(duì)照，已知TGF－β1和TNF－α陽性組織切片做陽性對(duì)照。TGF－β1和TNF－α陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：整體觀察每張切片，以成纖維細(xì)胞中胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為TGF－β1陽性表達(dá)細(xì)胞；以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆?；蚱瑺罱Y(jié)構(gòu)為TNF－α陽性表達(dá)。

4 圖像分析及定量分析 采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析軟件，切片在光鏡下統(tǒng)一放大400倍進(jìn)行測量。每張切片按等距離抽樣原則隨機(jī)攝取5個(gè)視野，輸入計(jì)算機(jī)作為測定視野。分別測定出每個(gè)視野中陽性表達(dá)面積百分比，進(jìn)而計(jì)算出平均陽性表達(dá)面積百分比，作為其陽性表達(dá)值。判定標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)（－）：無陽性染色；Ⅰ級(jí)（＋）：陽性染色面積占0～25%；Ⅱ級(jí)（?）：陽性染色面積占25%～50%；Ⅲ級(jí)（?）：陽性染色面積占50%～75%；Ⅳ級(jí)（■）：陽性染色面積占75%以上。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)處理所有數(shù)據(jù)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腹腔粘連情況觀察 大鼠腹腔解剖實(shí)驗(yàn)觀察見圖1，HA－HES實(shí)驗(yàn)組大鼠的腹腔粘連程度與生理鹽水對(duì)照組和HA－CMC對(duì)照組比較，HA－HES實(shí)驗(yàn)組粘連程度最輕。生理鹽水對(duì)照組粘連面積為0．80±0．16cm2，HA－CMC對(duì)照組粘連面積為0．64±0．15cm2，HA－HES實(shí)驗(yàn)組粘連面積0．06±0．10cm2。HE染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組明顯有血管生成，成纖維細(xì)胞增多，HA－CMC對(duì)照組血管增生不明顯，但粘連面積較大，見圖2。生理鹽水對(duì)照組均為Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)粘連；HA－CMC對(duì)照組均為Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)粘連；HA－HES實(shí)驗(yàn)組均為0級(jí)或Ⅰ級(jí)粘連；HA－HES實(shí)驗(yàn)組粘連分級(jí)及粘連發(fā)生率情況比生理鹽水組和HACMC對(duì)照組明顯減輕，差異顯著（P＜0．05），見表1。

表1 各組腹膜粘連等級(jí)比較結(jié)果

2 TGF－β1及TNF－α的表達(dá) 在正常腹膜組織和粘連組織中，鏡下可見TGF－β1蛋白主要表達(dá)與成纖維細(xì)胞的胞核或胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或黃色顆粒狀物質(zhì)（圖3，A、B、C、D）。粘連組織中 TGF－β1表達(dá)于術(shù)后開始逐漸升高，通過測定陽性表達(dá)值，假性粘連組陽性表達(dá)為0級(jí)占60%，Ⅰ級(jí)占20%，Ⅱ級(jí)占20%；生理鹽水對(duì)照組陽性表達(dá)為Ⅱ級(jí)占20%，Ⅲ級(jí)占40%，Ⅳ級(jí)占40%；HA－CMC對(duì)照組陽性表達(dá)為Ⅰ級(jí)占20%，Ⅱ級(jí)占60%，Ⅲ級(jí)占20%；HA－HES實(shí)驗(yàn)組0級(jí)占20%，Ⅰ級(jí)占40%，Ⅱ級(jí)占40%，較生理鹽水對(duì)照組陽性表達(dá)等級(jí)0級(jí)高20%，Ⅰ級(jí)高40%，Ⅱ級(jí)高20%，較HA－CMC對(duì)照組陽性表達(dá)等級(jí)0級(jí)高20%，Ⅰ級(jí)高20%。HA－HES實(shí)驗(yàn)組與生理鹽水對(duì)照組和 HACMC對(duì)照組相比較，TGF－β1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表2。在腹膜損傷及粘連組織中，鏡下可見TNF－α在纖維組織中的巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色的顆粒狀，細(xì)胞核被復(fù)染成藍(lán)色（圖3，E、F、G、H）。術(shù)后粘連組織中TNF－α表達(dá)逐漸升高，通過陽性表達(dá)測定，發(fā)現(xiàn)HA－HES實(shí)驗(yàn)組陽性表達(dá)等級(jí)最低，生理鹽水對(duì)照組陽性表達(dá)等級(jí)最高，HA－CMC對(duì)照組居于二者之間。HA－HES實(shí)驗(yàn)組陽性表達(dá)等級(jí)0級(jí)占20%，Ⅰ級(jí)占40%，Ⅱ級(jí)占40%；較HA－CMC對(duì)照組0級(jí)高20%，Ⅰ級(jí)高20%，Ⅱ級(jí)高20%；較生理鹽水對(duì)照組0級(jí)高20%，Ⅰ級(jí)高40%，，Ⅱ級(jí)高40%；HA－HES實(shí)驗(yàn)組與生理鹽水對(duì)照組和HA－CMC對(duì)照組相比較，TNF－α表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表2。

圖1 大鼠腹膜粘連的效果圖

圖2 HE染色在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的效果（×400）

圖3 TGF－β1和TNF－α在正常組織和粘連組織中的表達(dá)（×400）

表2 TGF－β1和TNF－α在各實(shí)驗(yàn)組腹膜損傷處及粘連組織中的表達(dá)情況比較結(jié)果（n＝5）

討 論

術(shù)后腹膜粘連產(chǎn)生的過程大致分為3個(gè)階段［5］：炎癥階段：腹膜損傷后，局部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞釋放出組胺和細(xì)胞因子等炎癥調(diào)節(jié)物，引起富含纖維蛋白的血漿液滲出。纖維蛋白溶解階段：機(jī)體正常纖溶平衡被破壞，纖維蛋白的溶解減少，沉積增加，在損傷腹膜表面形成纖維蛋白構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。纖維化階段：巨噬細(xì)胞受到炎性因子的趨化，向炎癥部位運(yùn)動(dòng)，釋放出大量TGF－β和TNF－α等細(xì)胞因子；這些細(xì)胞因子刺激組織中的纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成纖維細(xì)胞，數(shù)量成倍增加，膠原纖維大量沉積，纖維化程度加重。最終導(dǎo)致腹膜粘連的形成。

在上述腹膜粘連形成過程中，TGF－β和TNF－α在腹膜粘連形成過程中起到重要的作用［6］。大量文獻(xiàn)表明，TGF－β在炎癥反應(yīng)、腫瘤血管形成中大量表達(dá)。2003年美國的Freeman等［7］在SD大鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)手術(shù)刮傷漿膜引起腹膜粘連，粘連組織中TGF－β1和TGF－β3的mRNA表達(dá)分別比對(duì)照組的高3．7倍和8．6倍。此外，TGF－β有促進(jìn)新生血管生成的作用。TNF－α主要由激活的巨噬細(xì)胞分泌，在人和動(dòng)物的脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞亦可產(chǎn)生。TNF－α具有多種生物學(xué)活性，研究證實(shí)［8］，TNF－α能促進(jìn)肺、肝、腹膜和皮膚等組織纖維化過程中成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)粘連形成。

本研究顯示TGF－β1和TNF－α主要在腹膜組織的成纖維細(xì)胞中，應(yīng)用免疫組化技術(shù)測定粘連組織中的表達(dá)率比正常腹膜組織中高，而且生理鹽水對(duì)照組和HA－CMC對(duì)照組的 TGF－β1和 TNF－α表達(dá)明顯高于HA－HES實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)，利用 HE染色可以觀察到HA－HES實(shí)驗(yàn)組腹膜粘連程度低于生理鹽水對(duì)照組和HA－CMC對(duì)照組。說明HA與HES混合制備的新型防粘連劑對(duì)TGF－β1和TNF－α的表達(dá)有明顯的抑制作用，從而證明HA－HES防粘連劑預(yù)防術(shù)后腹膜粘連形成的一條重要機(jī)理在于抑制炎性滲出液中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，特別是TGF－β1和TNF－α的表達(dá)水平，從而起到有效地預(yù)防粘連的作用。

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