于開源，鞠曉峰，鄭麗娜

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

酸漿Physalis alkekengil，茄科植物，又名錦燈籠、掛金燈、紅菇。我國主要產(chǎn)地為內(nèi)蒙古呼倫貝爾盟和黑龍江大興安嶺地區(qū)[1-2]。果實不僅有很好的藥用價值，而且還有很高的食用價值，酸漿味酸、苦，性寒。具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用[3]。酸漿籽中的蛋白質(zhì)含有多種氨基酸，人體必需的氨基酸俱全，它不僅擁有許多藥用價值，而且還是一種很好的保健品，酸漿籽中的蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，具有很大的發(fā)展前景，有待于進一步開發(fā)和利用。酸漿蛋白的研究很少，漿果含酸漿醇A、B；種子中含禾本甾醇、鈍葉醇、環(huán)木菠蘿烷醇、環(huán)木菠蘿烯等[4-5]。目前對于植物種籽中蛋白質(zhì)的提取方法很多，有熱水提取法、超聲提取法、酶法等[6-9]。但這些工藝都不是很成熟，最成熟的方法是采用堿提酸沉法。加酸至等電沉淀蛋白法是從提取液中分離蛋白的最簡單的方法，它能確保提取液中的蛋白最大程度的沉淀，采用此方法可以將材料中含量很少的蛋白提出來，酸漿中的蛋白質(zhì)的含量極少，對于其它的提取方法均不能有效的將其提取并測試出來，故在論文中選擇了堿提酸沉法作為酸漿籽蛋白的提取工藝[10]。論文主要是研究經(jīng)過超臨界萃取后的酸漿籽粕為原料，通過響應(yīng)面優(yōu)化確定提取蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)，由于響應(yīng)法優(yōu)化準確率很高，誤差小，現(xiàn)被廣泛采用[11-12]，因此在實驗設(shè)計上主要采用響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計，可以為酸漿籽中蛋白質(zhì)的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和幫助，為進一步開發(fā)其相關(guān)產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。

1 實驗設(shè)計與方法

1.1 實驗材料

酸漿果實，購于黑龍江省建三江農(nóng)管局（七星農(nóng)場）；超臨界CO2萃取后的脫脂酸漿籽粕（黑龍江八一農(nóng)大學(xué)食品學(xué)院自制）。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿提酸沉法籽粕工藝流程

酸漿脫脂籽粕——堿液浸提——離心（4 000 r·min-1、20 min）——過濾——清液——加HCL 調(diào)pH 至等電點——離心分離——沉淀——冷凍干燥——酸漿籽蛋白質(zhì)

1.2.2 pH 對酸漿籽粕蛋白提取的影響

準確稱取2.000 g 粉碎后酸漿籽粕5 份，用NaOH 調(diào)整磷酸二氫鉀—磷酸氫二鈉浸提液的pH分別至7、8、9、10、11，然后按料液比1∶25，分別加入pH 為7、8、9、10、11 的磷酸二氫鉀—磷酸氫二鈉浸提液，在40 ℃下攪拌浸提1 h，將上清倒入離心管中離心20 min（4 000 r·min-1），用凱氏定氮法測定其中的蛋白質(zhì)提取率及確定最佳pH。

1.2.3 溫度對酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

準確稱取2.000 g 粉碎后酸漿籽粕，按1∶25 的料液比加入前述試驗中確定的最佳pH 值浸提液，至于30，35，40，45，50 ℃下攪拌浸提1 h，同上，測定蛋白質(zhì)的提取率及確定最佳溫度。

1.2.4 料液比對酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

準確稱取2.000 g 粉碎后酸漿籽粕，按1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 的料液比，加入最佳pH 的浸提液，在最佳溫度條件下攪拌浸提1 h，同上，測定蛋白質(zhì)的提取率及確定最佳料液比。

1.2.5 提取時間對酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

準確稱取2.000 g 粉碎后酸漿籽粕，選取最佳料液比及最佳pH 浸提液，在最佳溫度下分別浸提20、30、40、50、60 min，同上測定蛋白質(zhì)的提取率及確定最佳提取時間。

1.2.6 酸沉等電點的確定

酸沉等電點的確定取50 mL 蛋白質(zhì)提取上清液7 份，分別用1 mol·L-1HCl 調(diào)節(jié)pH 值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，靜置2～3 h，離心分離后，將上清液稀釋40 倍后進行比色測定。

1.3 分析方法

蛋白質(zhì)的測定：采用凱氏定氮法（氮對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)取5.95）。按下式計算蛋白質(zhì)提取率和制品的純度。蛋白質(zhì)等電點的測定：采用比色法測定。

蛋白質(zhì)的提取率=提取液中蛋白質(zhì)含量/ 酸漿籽粕中蛋白質(zhì)含量×100%

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.1 浸提液pH 對酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

不同pH 溶液處理對酸漿籽中蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 浸提液pH 對酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of extract pH of Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

在pH7～9 的范圍內(nèi)，隨著pH 的升高，蛋白質(zhì)的提取率升高，當(dāng)pH 為9 時，蛋白質(zhì)的提取率達到最大；隨后隨著pH 的升高，提取率反而下降，且樣品液體中有異味。當(dāng)pH 較高時，蛋白質(zhì)過度水解，提取率降低，同時氨基酸之間有可能發(fā)生縮合反應(yīng)，生成了異味物質(zhì)。有研究表明，堿性太強可引起脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴反應(yīng)，將氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸净衔?。因此，提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)的適宜pH 為9。

2.1.2 溫度對酸漿蛋白質(zhì)提取率的影響

以pH=9 和固液比1∶25 測定不同溫度對蛋白質(zhì)的提取率的影響，結(jié)果見圖2。

從圖2 知，在溫度50 ℃時酸漿籽粕中蛋白的提取率最大；30～50 ℃時，提取率隨溫度的升高而增加；這是由于隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象會發(fā)生微變，有利于蛋白質(zhì)分子和水分子的運動及其相互作用，溫度的升高對蛋白質(zhì)溶解起到了增溶作用，當(dāng)溫度由此點升高時，蛋白質(zhì)隨溫度的升高而降低，這是由于溫度過高可造成部分蛋白質(zhì)變性。因此，提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)的適宜溫度為50 ℃。

圖2 溫度對酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of the temperature on protein extraction rate of Physalis alkekengi seed meal protein

2.1.3 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

不同料液比對酸漿蛋白質(zhì)提取率的影響，見如圖3。

圖3 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Material liquid ratio on protein extraction rate influence

從圖3 可知，蛋白質(zhì)的提取率隨料液比的增加而增大。當(dāng)料液比為1∶10 時，蛋白質(zhì)的提取率26.52%，遠低于其它實驗組，這是由于酸漿籽粕中含有一定量的膳食纖維，具有較強的吸水膨脹能力，使物料因流動性差而難于攪拌，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率低。當(dāng)料液比為1∶25 時，提取率為最大，隨著料液比的增大，提取率下降，由于料液比對其它影響考慮不是很明顯，故在響應(yīng)值設(shè)計時，不做考慮，提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)的最佳料液比為1∶25。

2.1.4 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

選取在溫度40 ℃，料液比1∶25，pH=9，提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對酸漿蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of Physalis alkekengi protein

從圖4 可知，在一定條件下，在提取時間為20～40 min 的范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，酸漿籽粕中蛋白質(zhì)的提取率升高，當(dāng)提取時間為40 min 時，蛋白質(zhì)的溶出率最高，蛋白質(zhì)的提取率達到最大；隨后隨著提取時間的延長，提取率反而下降。因此，提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)的最佳提取時間為40 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取條件

根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設(shè)計原理，以提取液pH、提取溫度、提取時間三個因素為自變量（分另為X1，X2，X3表示），以酸漿籽粕中蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值設(shè)計三因素三水平共15 個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，15 個實驗點分為12 個析因點和3 個零點，每個試驗因素水平選取如表1：

表1 酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取工藝三因素三水平響應(yīng)面分析試驗設(shè)計表Table 1 Physalis seed meal protein extract process three factors and three levels of response surface analysis test design

實驗以隨機次序進行，將實驗所得的多糖提取率用Minitab15.0 程序進行分析，得出響應(yīng)面分析圖、回歸擬合方程以及方差分析表。響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 堿溶酸提法提取條件優(yōu)化實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Alkali and acid extraction condition optimizing the experimental design and results

表3 三因素三水平中心組合參數(shù)估計Table 3 Three factors and three levels center combination parameter estimation

利用Minitab 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，由表3得出擬合二次多項式方程為：

Y=55.460 0-1.571 3 X1-0.362 5 X2-1.166 3 X3-16.000 0 X12-3.652 5 X22-3.145 0 X32+1.667 5 X1X2-2.970 0 X1X3+0.307 5 X2X3

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表3 知，對方程影響顯著程度由大到小依次為提取液pH、提取溫度、提取時間，其中提取液pH處理比提取溫度、提取時間對方程影響最為顯著，這說明提取液pH 對實驗起關(guān)鍵作用，用堿液處理后，時間過長物料可能變性，影響其提取率，并且得知方程一次項和二次項是極顯著的，所以各因素之間并不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。由表4 知模型的回歸顯著，交互作用較好；失擬項F 值很小為0.32，表明該方程對實驗擬合情況好，實驗誤差小。因此可以用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。

同時做出中心組合設(shè)計試驗所得的三組響應(yīng)面曲面圖（圖5～圖7）。響應(yīng)面圖形是特定的響應(yīng)值Y（酸漿蛋白質(zhì)提取率）對應(yīng)的因素X1、X2、X3構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對響應(yīng)值的影響。圖中可看到擬合曲面有最大值，對擬合方程求偏導(dǎo)，可得出模型最大值，即為最優(yōu)的試驗方案。

圖5 pH 值和溫度對酸漿籽粕蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

圖6 pH 值和提取時間對酸漿籽粕蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of pH and extract time on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

圖7 提取溫度和提取時間對酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.7 Effect of temperature and time on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

為了進一步確證最佳點的值，利用上述分析進行最優(yōu)工藝的推導(dǎo)，對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)為零并整理得：

聯(lián)立上述（2）、（3）、（4）三個方程求解，得到X1=0.030 5，X2=0.033 5，X3=0.218 3。換算后得到最佳工藝條件是pH 為9.1、提取溫度為50.1 ℃、提取時間為42.2 min。由回歸方程預(yù)測酸漿蛋白質(zhì)提取的理論提取率為51.9%。

設(shè)計上為了檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果，采用上述優(yōu)化條件重復(fù)實驗3 次，將提取率工藝參數(shù)修正為：pH 為9.0，提取溫度為50 ℃，提取時間為42 min。在此條件下實際多糖提取率為49.1%，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.41%，說明了回歸方程的預(yù)測值與實驗值之間具有較好的擬合度。

3 結(jié)論

3.1 對堿提工藝中影響蛋白質(zhì)提取率的提取液pH值、提取溫度、料液比、提取時間4 個單因素進行實驗，結(jié)果表明：提取液pH 值、提取時間提取溫度對酸漿籽粕蛋白質(zhì)的提取率影響顯著，而料液比的影響不顯著。

3.2 采用響應(yīng)化優(yōu)化堿提工藝參數(shù)，以最終提取純蛋白質(zhì)為指標(biāo)，確定堿提最佳工藝參數(shù)為：提取液pH=9.0，提取溫度50 ℃，料液比1∶25，浸提42 min。按此工藝條件提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)，提取率為49.1%。

3.3 通過驗證性實驗證明了響應(yīng)面優(yōu)化的實驗條件的可靠性，實驗結(jié)果與預(yù)測值具有較好的擬合，證明采用響應(yīng)法優(yōu)化對微波法輔助提取酸漿籽中蛋白質(zhì)的提取率實驗設(shè)計可靠，具有可行性。

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