趙 培，龐廣昌，王雪青，田 強，姚 遠，王 菲

（天津商業(yè)大學a.生物技術與食品科學學院，b.天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

絲素是將蠶絲脫膠后得到的天然蛋白質，不溶于水.由于絲素蛋白具有良好的易加工性[1]和氧氣及水的滲透性，被廣泛應用于組織工程細胞生長支架、臨床診斷、外科修復、治療等方面[2-3].絲素蛋白所具有的2種不同結晶結構（silk I和silk II），成為細胞和組織沿軸向生長的物質基礎[4].但純絲素一般溶失率很高，不經(jīng)溶化處理（甲醇浸泡或濕熱）的絲素蛋白，強度較大，伸長很小，玻璃轉化溫度（Tg）超過200℃，又硬又脆，很難在生物體內使用，所以必需經(jīng)預處理后才可以作為細胞黏附的基質[5-6].

本研究采用不同的脫膠方法、包埋方式、纏繞方式對絲素進行預處理，制得改性絲素，通過細胞培養(yǎng)實驗研究其生物學特性，期望能夠對絲素蛋白材料進行改良，而且有利于細胞的生長和分化.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與蠶絲

細胞為293T細胞（人胚腎細胞）；蠶絲為正常繭紡絲，購自遼寧太源紡織有限公司.

1.1.2 試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)液：上?？寺∩锘瘜W試劑（北京）有限公司；小牛血清：北京華利森泰生物科技有限公司；質量分數(shù)0.25%的胰蛋白酶、MTT：中國醫(yī)學科學院血液學研究所科技公司；其他試劑，包括DMSO、聚乙二醇、明膠、殼聚糖等，均采用國產(chǎn)分析純.

Nikon Ti倒置顯微鏡；Thermo Labsystems酶聯(lián)免疫檢測儀；Thermo Scientific Heraeus HERAcellCO2培養(yǎng)箱；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司生產(chǎn).

1.2 實驗方法

1.2.1 293T細胞的培養(yǎng)

質量分數(shù)為90%的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入質量分數(shù)為10%的胎牛血清和0.1%的雙抗（青霉素和硫酸慶大霉素），37℃培養(yǎng).

1.2.2 蠶絲預處理

先將蠶絲置于沸水中20 min，除雜.

2種脫膠方法：酶脫膠法和NaHCO3脫膠法.將蠶絲分別放入質量分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶溶液和質量分數(shù)為0.6%的NaHCO3溶液中（浴比同為1∶40），37℃恒溫下消化12 h.

2種腐蝕方法：將等量絲素分別放入1.0 mol/L HCl、1.0 mol/L NaOH中常溫保存1 h.

2種包埋方法：明膠包埋，將等量的絲素放入質量分數(shù)為7%的明膠水溶液中，常溫保存1 h；殼聚糖/聚乙二醇包埋，稱取0.6 g殼聚糖，少量醋酸溶解，除去雜質，氨水調節(jié)pH值至5，透析除去醋酸、醋酸胺等小分子.稱取0.24 g聚乙二醇，加入20 mL雙蒸水，溶解，倒入殼聚糖溶液中，攪拌均勻，超聲振蕩，除去氣泡，滴加到絲素上.按上述方法制得的樣品用雙蒸水漂洗3次，然后37℃烘干，制得干性絲素薄膜片.用紫外線照射消毒30min，待用.

3種纏繞方法：脫膠絲素分別擰成1股、2股、3股螺旋狀.

1.2.3 絲素-293T復合培養(yǎng)

將制備好的絲素支架置于6孔板內.取處于對數(shù)期的293T細胞懸液，調整細胞密度為2×104/mL，取1 mL滴于支架上.37℃培養(yǎng)4 h，待細胞充分吸附在支架上后，加入4 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液，培養(yǎng)7 d，每個實驗2個平行.

1.2.4 MTT法檢測細胞活力

將絲素-293T復合培養(yǎng)體取出，以培養(yǎng)基反復輕輕吹打支架，直至顯微觀察蠶絲上無附著細胞，計數(shù).96孔板，每孔加細胞100 μL，培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，加MTT使其終質量濃度為0.5 mg/mL，培養(yǎng)4 h.每孔加入150 μL的DMSO，酶標儀上振蕩混勻，測定OD570值.每孔3個平行.

1.2.5 培養(yǎng)條件正交實驗設計

按L9（34）設計4因素、3水平實驗進行選擇，正交實驗因素水平見表1.

表1 蠶絲預處理方法考察因素及水平Tab.1 Factors and levels on the study of pretreated silk fibroin

2 結果與討論

2.1 293T細胞的生長形態(tài)

293T細胞是半貼壁半懸浮生長的腫瘤細胞，但在培養(yǎng)時貼附在支持物表面的生長情況要好于懸浮狀態(tài).細胞貼壁生長后形態(tài)發(fā)生變化，在游離態(tài)時，細胞為透明的圓球形；貼壁生長時變?yōu)椴灰?guī)則圓形或橢圓形、梭形、多角形，同時形成許多偽足狀突起，相鄰細胞伸出數(shù)個長突起向外延伸，如圖1.

圖1 293T細胞在培養(yǎng)瓶中的生長形態(tài)Fig.1 Growth state of 293T in cell culture flask

2.2 293T細胞在支架上的生長狀態(tài)

圖2 揭示出不同預處理方式對293T細胞與蠶絲的黏附有一定的影響，主要表現(xiàn)在是否脫膠與包埋方式上.已證明人們不期望的免疫反應是由絲膠蛋白引起的[7].由圖2可以看出，在脫膠后裸露的絲素（4～9）上都有較多細胞黏附.采用HCl和NaOH腐蝕蠶絲的目的是用酸或堿腐蝕絲素表面，造成表面粗糙，表觀看HCl和NaOH腐蝕與無腐蝕差別不大（2與3、5與6、8與9）.就包埋方式而言，經(jīng)明膠包埋的絲素上的293T細胞呈線、片平鋪（4、9）.圖2也顯示出殼聚糖/聚乙二醇處理的絲素上的293T細胞多數(shù)黏附在絲素纖維上，且聚集呈團簇狀生長，并沿絲素纖維生長，生長旺盛（5）.這是由于混合處理時聚乙二醇增加了絲素的親水性，聚乙二醇分子中存在大量乙氧基，能夠與水形成氫鍵，具有良好的親水性，且親水性的材料表面有利于細胞的黏附生長[8].聚乙二醇鏈在水中的高遷移率促進了293T細胞的黏附和生長，混合了殼聚糖后，纖維的韌性、彈性、細胞黏附性和增值能力均顯著提高.何領好等[9]也證實殼聚糖/聚乙二醇共混膜隨著聚乙二醇含量的增加，膜的玻璃化轉變溫度、結晶度和剛度降低.可見幾種處理方法相比，以殼聚糖/聚乙二醇聯(lián)合作用的細胞生長狀態(tài)最佳.這與其他研究者關于殼聚糖/聚乙二醇對細胞的生物相容性結果相似[10-12].就纏繞方式而言，293T細胞黏附在1股絲素纖維表面上且生長的較密集，而在2股和3股絲素纖維上不僅生長在單根絲素上，而且還生長在2股或3股絲素纖維之間的夾縫中（4，6）.

圖2 9組實驗的細胞在絲素上的生長狀態(tài)Fig.2 Growth state of 9 groups′experiments cells on silk fibroin

上述結果為培養(yǎng)3 d，實驗4～6發(fā)現(xiàn)，處理時間越長293T細胞與絲素結合得越緊密，不受外力干擾，操作時洗脫越難.培養(yǎng)7 d的細胞團緊密結合成不規(guī)則團塊狀，密布于絲素表面，但培養(yǎng)基澄清透明.而實驗1～3培養(yǎng)7 d時若不及時換液，板底見大片泛白死細胞，輕搖就有細胞浮起.

以上實驗結果說明：細胞與支架間黏附作用受材料表面性質、細胞與材料接觸時間、材料的柔韌性等多種因素影響，材料本身的生物相容性也決定了細胞在材料表面的形態(tài)學特點及增殖、分化的能力.

2.3 絲素預處理方式對細胞數(shù)和活力的影響

以不同的脫膠方法、包埋方式、纏繞方式對蠶絲進行預處理的正交實驗及數(shù)據(jù)結果如表2，直觀分析和方差分析見表3和表4.

表2 預處理對絲素促進293T細胞生長的正交實驗及結果Tab.2 Orthogonal design and results of pretreated silk fibroin to promote the growth of 293T

表3 正交實驗結果的直接分析Tab.3 Direct analysis on the orthogonal design results

表4 正交實驗結果的方差分析Tab.4 Analysis of variance of orthogonal test

根據(jù)表3對4因素的極差（R）進行比較，可見脫膠方法的極差最大，其次是包埋法，腐蝕法與纏繞法之間的差異并不大.極差越大，在該因素的水平變動時293T細胞的細胞數(shù)與活力變化就越大，也就是該因素對293T細胞生長狀態(tài)的影響越大.因此，按照極差大小順序排列，可知脫膠方法是影響293T細胞在絲素支架上生長的主要因素.K1、K2、K3之間的差異是因為同一因素取3個不同的水平所引起的，K值大表明某一因素在該水平下處理效果最好.根據(jù)水平之間K值大小比較得知，若要獲得高的生物量其最佳組合為胰蛋白酶脫膠、NaOH腐蝕、殼聚糖/聚乙二醇包埋、2股纏繞；若要獲得高的細胞活性其最佳組合為胰蛋白酶脫膠、HCl腐蝕、殼聚糖/聚乙二醇包埋、3股纏繞.根據(jù)表4可知，脫膠方法與包埋法對結果的影響最明顯，具有統(tǒng)計學意義（P≤0.01）.

不管哪種方式處理后的絲素支架對293T細胞的吸附效果均強于未脫膠蠶絲，且便于取放和易于保持構型.本研究中對蠶絲預處理后作為293T細胞生長的支架，獲得了高生物量與高活性的293T細胞.絲素支架經(jīng)培養(yǎng)后293T細胞生物量由2×104/mL最大增加到7×105/mL左右，增長量為35倍，明顯高于陸旋等[13]以常規(guī)靜電紡絲法得到的增長量；并高于葉榮等[14]的小鼠胚胎細胞ES在絲素蛋白膜或明膠上生長后的MTT活性測定結果.由表3的結果可知，腐蝕法與纏繞法之間的差異并不大，據(jù)此認為對絲素進行的腐蝕步驟可以省略.至于纏繞方式在組織工程中的應用，2股和3股絲素纖維的機械強度要好于1股絲素纖維，具有較高的抗拉伸力學性能.鑒于目前所制備的絲素支架都是絲素纖維排列緊密、網(wǎng)孔小的網(wǎng)狀結構[15]或成膜結構[16-17]，而絲素可以制成海綿狀、膜狀、纖維狀和網(wǎng)狀等，因此制備細胞培養(yǎng)支架時，根據(jù)具體的情況也可以選擇使用多股絲素.

3 結論

3.1 293T細胞在絲素上的生長

293T細胞在處理過的絲素上經(jīng)過3 d培養(yǎng)后，在材料表面普遍都能很好地生長，細胞突起明顯，貼附良好，多數(shù)細胞突起減少，胞體變圓.經(jīng)過7 d培養(yǎng)后，細胞呈球狀體、錐形體，有的還會形成偽足突起向外延伸，大量附著在絲素纖維上呈集落性生長.在絲素纖維上生長的293T細胞與在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細胞相比表現(xiàn)出更加立體的形態(tài).

3.2 不同預處理方式對293T細胞數(shù)、細胞活力的影響

正交實驗分析表明：脫膠方法對293T細胞數(shù)和細胞活力的影響最大；其次是包埋法；腐蝕法與纏繞法之間的差異并不大.若要獲得高的生物量，最佳組合為胰蛋白酶脫膠、NaOH腐蝕、殼聚糖/聚乙二醇包埋、2股纏繞；若要獲得高的細胞活性，最佳組合為胰蛋白酶脫膠、HCl腐蝕、殼聚糖/聚乙二醇包埋、3股纏繞.脫膠方法與包埋法對結果的影響最顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P≤0.01）.

實驗結果會因操作過程而產(chǎn)生一定的誤差，是由于絲素支架接種細胞后，在換液和補加培養(yǎng)液時不可避免地會沖擊細胞-絲素支架復合物，這時未牢固吸附于支架的細胞會脫落，并且細胞濃度降低也會造成細胞吸附的機會減少.但這種影響對研究細胞在蠶絲支架上生長情況的總體趨勢并無太大影響.脫膠后絲素纖維與293T細胞具有良好的生物相容性，并且有利于293T細胞的存活，同時對其表型或功能沒有任何大的毒害作用，說明絲素表面經(jīng)處理后有利于細胞的黏附和增殖.

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