李 敏， 張 健， 王奎山， 李玉娟， 談 峰， 王 瑩

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 如皋 226541)

大多數(shù)高等植物在受到鹽、干旱等脅迫時會在細胞內(nèi)積累大量甘氨酸甜菜堿(簡稱甜菜堿)來提高自身抵抗逆境環(huán)境因子脅迫的能力［1］。甜菜堿作為季胺類水溶性生物堿，具有滲透調(diào)節(jié)功能，能夠保護質(zhì)膜的完整性，有助于植物適應(yīng)非生物逆境［2-3］。

耐鹽柳樹，具有較強的耐鹽能力，能在含鹽0.4%、pH 10.4的土壤中正常生長，是中國沿海灘涂主要的造林樹種之一。耐鹽柳樹適應(yīng)性強，易繁殖，造林成活率高，生長迅速，無論在營造工業(yè)用材林，還是在防風固沙、水土保持、鹽堿地改造等方面都有廣闊的應(yīng)用前景［4］。目前，國內(nèi)外學者已從川芎(Liqusticum churning Franch Hort)、枸杞(Lycium barbarum)、刺五加(Eleutherococcus senticosus)、甘菊(Dendranthema lavandulifolium)、胡楊(Populus euphratica)、遼寧堿蓬 (Suaeda liaotungensis)、梭 梭(Haloxy lonammodendron)、鹽爪爪(Kalidium foliatum)、大麥(Hordeum vulgare L.)、鹽穗木 (Halostachys caspica)等［5-14］植物中相繼克隆得到甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因，但有關(guān)耐鹽柳樹BADH基因的研究還未見報道。本研究擬從耐鹽柳樹中克隆BADH基因，探討其與其他品種或物種同源基因的相似性，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并對其進行序列分析和在鹽脅迫下的表達分析，旨在為耐鹽柳樹種質(zhì)改良研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試植物為江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所選育的耐鹽柳樹L0911，取新鮮葉片，用液氮速凍存于－70℃冰箱待用。

1.2 試劑

引物 Taq DNA聚合酶、dNTP(10 mmol/L)、DNA marker和 PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(生工SK1141)、質(zhì)粒提取試劑盒(生工 SK1191 UNIQ-10)、熒光定量PCR用試劑盒(SK8661)、常規(guī)化學試劑等均購自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 RNA提取和總cDNA的合成

采用Trizol試劑(Invitrogen公司)參照試劑說明手冊提取總RNA?？俢DNA的合成用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(BBI公司)按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。

1.4 BADH 基因克隆

根據(jù)毛果楊(Populus trichocarpa)的PtBADH設(shè)計引物BADH F1:5'-AGCTCTCAACTCACTAATCGAGT-3';BADH R1:5'-TTATAGCTTGGCGGGAGACTG-3'。以L0911葉片總cNDA為模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，切膠回收，并進行T/A克隆(pMD18-T)。陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。所得的克隆序列為2次獨立PCR和3個以上質(zhì)粒的測序結(jié)果。

1.5 BADH基因的分子進化分析

在GenBank查找BADH基因的核苷酸和氨基酸相關(guān)序列，使用 Clustal W2進行多序列比對，MEGA5.0軟件中 Neighbor-Joining(NJ)法進行建樹，Bootstrap值設(shè)為1 000。

1.6 鹽處理

將水培生長健壯的柳樹L0911幼苗用200 mmol/L NaCl溶液分別處理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，取新鮮嫩葉片。將 L0911幼苗分別用 0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L 、300 mmol/L NaCl溶液處理12 h后，取新鮮嫩葉片。所有樣品用液氮速凍存于－70℃冰箱待用。

1.7 實時熒光定量PCR分析

根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計引物BADH F2(5'-GTGCCAAGTATTTGCGTGCTA-3')和BADH R2(5'-AAACAACCTGCGACATCATCC-3')，對L0911 BADH基因鹽脅迫處理后的響應(yīng)進行分析。用ubiquitin-like(UBQ-L)［15］為內(nèi)參基因，引物為 UBQ-L-F(5'-TGAGGCTTAGGGGAGGAACT-3')和UBQ-L-R(5'-T GTAGTCGCGAGCTGTCTTG-3')。將經(jīng)過鹽處理的柳樹L0911幼苗嫩葉進行總RNA提取以及cDNA合成。按柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(SK8661)配制PCR體系，于ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進行定量PCR檢測，測定其Ct值，用 F=2－△△Ct公式［16］計算樣品間目的基因的表達量差異。

2 結(jié)果

2.1 柳樹L0911 BADH基因的克隆

從圖1可以看出，引物BADH F1和BADH R1在柳樹L0911的cDNA模板中成功擴增到目的片段，長度大小符合預(yù)期目標。測序結(jié)果表明，L0911的BADH基因cDNA全長1 539 bp，具有起始密碼子、完整的開放閱讀框(1 512 bp)、終止密碼子、5'非編碼區(qū)(27 bp)，共編碼512個氨基酸。獲得的氨基酸序列與毛果楊PtBADH2、胡楊PeBADH2編碼序列以及擬南芥、水稻的氨基酸序列相似性達到95.83%、95.03%、82.31%、71.68%。說明本試驗獲得的基因與PtBADH2和PeBADH2是同源的。

圖1 引物BADH-F1/R1擴增柳樹L0911 cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.1 Amplification of Salix cultivar L0911 cDNA by PCR using primers BADH-F1/R1

2.2 柳樹L0911氨基酸序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

用MEGA 5.0對BADH基因編碼的氨基酸序列進行分子進化分析，結(jié)果與用基因組序列(www.phytozome.net)分析結(jié)果一致。柳樹 L0911的BADH基因與楊樹位于相同的分支(圖2)。在胡楊［9］、白骨壤［17］、麻瘋樹［18］等植物中，BADH 基因的功能已有報道，本研究獲得的BADH可能具有相應(yīng)的生物學功能。

圖2 植物BADH基因編碼氨基酸的分子進化分析圖Fig.2 Phylogentic tree of BADH gene of various plants based on amino acids sequence

2.3 鹽脅迫下柳樹L0911 BADH基因的表達分析

2.3.1 不同濃度 NaCl溶液脅迫下柳樹L0911BADH基因的表達特性 以未進行NaCl脅迫處理的葉片中BADH基因的表達量為對照，對實時熒光定量中得到的目的基因BADH和內(nèi)參基因UBQ-L的平均Ct值，計算作圖，得到圖3?？梢钥闯隽鴺銵0911葉片中BADH基因的表達情況隨著鹽濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，在200 mmol/L NaCl脅迫下表達量最高，是對照的1.90倍。說明一定濃度的 NaCl脅迫可以誘導(dǎo)柳樹 L0911的BADH基因表達量增加，但鹽濃度過高BADH基因表達量又會下降。

圖3 不同NaCl濃度脅迫12 h后柳樹L0911 BADH基因的表達Fig.3 Expression of BADH gene of Salix cultivar L0911 under NaCl stress for 12 h at different concentrations

2.3.2 NaCl不同脅迫時長下 L0911BADH基因的表達特性 從圖4可以看出，隨NaCl脅迫時間的延長，葉片中BADH基因表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。脅迫初期(3 h)，L0911 BADH基因表達量低于對照;隨著時間的延長，表達量逐漸增大，脅迫12 h時達到最高，是對照組的1.88倍，說明鹽脅迫能誘導(dǎo)該基因表達量的增加;隨著時間進一步延長，表達量逐漸降低，脅迫72 h時表達量低于對照水平。

圖4 200 mmol/LNaCl脅迫不同時間柳樹L0911 BADH基因的表達Fig.4 Expression of BADH gene of Salix cultivar L0911 under 200 mmol/L NaCl stress for different times duration

3 討論

植物在干旱、鹽堿等逆境條件下可積累大量甜菜堿，而植物體內(nèi)甜菜堿的合成途徑相對簡單，主要經(jīng)兩步催化合成，即乙酰膽堿→甘氨酸甜菜堿醛→甘氨酸［19］。甜菜堿合成后不能進一步代謝，積累在細胞中作為永久性或半永久性滲透調(diào)節(jié)劑［20］。因此，甜菜堿合成途徑中的甜菜堿醛脫氫酶(BADH)被認為是最有希望的脅迫抗性基因之一，BADH的分子生物學與生物化學研究引起了廣泛關(guān)注。本研究從柳樹L0911克隆到BADH基因，并對該基因的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化、表達模式進行了比較詳細的研究。

本研究采用同源克隆法從柳樹L0911cDNA中擴增并克隆了BADH基因。測序結(jié)果表明，該基因含有1個完整的開放閱讀框架，核苷酸序列全長為1 539 bp，推測的氨基酸序列全長為512個氨基酸殘基。氨基酸序列同源性分析表明L0911的BADH基因與毛果楊、胡楊等同源性最近，為95%，與水稻的同源性為71%。L0911的BADH氨基酸序列同源性分析也表明BADH在高等植物中是相對保守的。

植物在逆境條件下會積累甜菜堿，BADH基因的表達活性又直接影響甜菜堿的合成。本試驗用熒光定量的方法檢測柳樹L0911在鹽脅迫下BADH mRNA的表達情況。結(jié)果表明，BADH基因是受鹽誘導(dǎo)的，當鹽濃度升高至200 mmol/L時，表達活性最大;在同一鹽濃度下，隨著鹽脅迫時間的延長，在一定范圍內(nèi)，表達活性也增大。Arakawa等［21］研究結(jié)果表明大麥(Hordeum vulgare)BADH酶活性隨著鹽濃度的增加而增大;Reda等［22］研究結(jié)果也表明鹽角草(Salicornia europaea)和堿蓬(Suaeda maritima)的BADH mRNA在鹽脅迫下的表達水平增加，本研究結(jié)果與他們基本一致。這為進一步揭示L0911的耐鹽機制及利用該基因進行遺傳工程創(chuàng)造耐鹽新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

［1］CHEN T H H，MURATA N.Glycinebetaine:an effective protectant against abiotic stress in plants［J］.Trends Plant Sci，2008，13(9):499-505.

［2］朱先燦，胡鳶雷，王曉麗，等.兩種濱藜甜菜堿醛脫氫酶基因的克隆及序列分析［J］.生物技術(shù)通報，2007(6):89-91.

［3］劉 萍，丁義峰，于 娜，等.維生素C與甘氨酸甜菜堿對芍藥花瓣生理生化的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011，39(6):267-269.

［4］解孝滿，李景濤，劉建軍，等.柳樹無性系苗期試驗分析［J］.山東林業(yè)科技，2008(3):44-45.

［5］周嘉裕，廖 海.川芎甜菜堿醛脫氫酶基因的克隆及序列分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2011，20(3):45-51.

［6］田躍勝，許潔婷，唐克軒，等.枸杞甜菜堿醛脫氫酶基因全長cDNA的克隆與表達分析［J］.揚州大學學報，2010，31(2):48-52.

［7］邢朝斌，吳 鵬，陳 龍，等.刺五加GAPDH基因的克隆及序列分析［J］.中草藥，2012，43(1):155-158.

［8］劉振林，曹華雯，夏新莉，等.甘菊BADH基因cDNA的克隆及在鹽脅迫下的表達［J］.武漢植物學研究，2009，27(1):1-7.

［9］劉佳琪，楊 雪，李 迪，等.胡楊甜菜堿醛脫氫酶基因的功能分化［J］.生物工程學報，2012，28(3):329-339.

［10］李秋莉，張 毅，尹 輝，等.遼寧堿蓬甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)啟動子分離及序列分析［J］.生物工程學報，2006，22(1):77-81.

［11］石 磊，甘曉燕，陳虞超，等.梭梭甜菜堿醛脫氫酶基因克隆及序列分析［J］.西北植物學報，2010，30(2):223-228.

［12］曾幼玲，幸 婷，蔡忠貞，等.鹽生植物鹽爪爪甜菜堿醛脫氫酶基因的克隆及在鹽脅迫下的BADH基因的表達［J］.云南植物研究，2007，29(1):79-84.

［13］ZHAO Y W，HAO J G，BU H Y，et al.Cloning of HvBADH gene from hulless barley and its transformation to tobacco［J］.Acta Agronomica Sinica，2008，34(7):1153-1159.

［14］胡有貞，張富春，曾幼玲，等.鹽穗木甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)的克隆及其在鹽脅迫下的表達分析［J］.植物生理學通訊，2010，46(1):47-50.

［15］關(guān)亞麗.柳樹AP3同源基因的克隆與表達分析［D］.南京:南京林業(yè)大學，2006.

［16］LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－△△Ctmethod［J］.Method，2001，25:402-408.

［17］周涵韜，李 芳，張賽群，等.紅樹植物白骨壤甜菜堿醛脫氫酶基因的克隆與功能研究［J］.廈門大學學報，2008，47(增刊2):11-15.

［18］ZHANG F L，NIU B，WANG Y C，et al.A novel betaine aldehyde dehydrogenase gene from Jatropha curcas，encoding an enzyme implicated in adaptation to environmental stress［J］.Plant Science，2008，174:510-518.

［19］TAKABE T，RAI V，HIBINO T.Metabolic engineeringof glycine betaine［M］//RAI A K，TAKABE T.Abiotic stress tolerance in plants.Berlin:Springer，2006:137-151.

［20］KUMAR S，DHINGRA A，DANIELL H.Plastid-expressed betaine aldehyde dehydrogenase gene in carrot cultured cells，roots，and leaves confers enhanced salt tolerance［J］.Plant Physiol，2004，136(1):2843-2854.

［21］ARAKAWA K，KATAYAMA M.Levels of betaine and betaine aldehyde dehydrogenase activity in the green leaves，and etiolated leaves and roots of barley［J］.Plant Cell Physiol，1990，31:797-803.

［22］MOGHAIEB R E A，SANEOKA S，F(xiàn)UJITA K.Effect of salinity on osmotic adjustment，glycinebet aine accumulation and the betaine aldehyde dehydrogenase gene expression in two halophytic plants，Salicornia europaea and Suaeda maritime［J］.Plant Sci，2004，166:1345-1349.