趙麗華

(西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615000)

石榴(Punica granatum L.)為石榴科(Punicaceae)石榴屬(Punica)落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)伊朗、阿富汗、印度等中亞一帶［1］，石榴屬有3個(gè)種:P.granatum、P.nana 及 P.protopunica，(2n=2x=16，18)，因?yàn)镻.granatum具有經(jīng)濟(jì)、觀賞及藥用價(jià)值而被廣泛栽培［2-3］。從西漢張騫將石榴引入中國(guó)，至今已有2000多年的栽培歷史，經(jīng)長(zhǎng)期天然雜交、基因突變、嫁接等，在中國(guó)產(chǎn)生了復(fù)雜多樣的品種和類(lèi)型。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，中國(guó)現(xiàn)有石榴品種資源230多個(gè)，形成了山東、新疆、陜西、安徽、河南、云南和四川7個(gè)主栽培區(qū)［4］。由于石榴是小雜果，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究的總體水平較落后，基因組信息非常有限，進(jìn)而影響了石榴的生產(chǎn)以及國(guó)內(nèi)、國(guó)際間的交流。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用 RAPD［5-6］、SRAP［7］、SSR［8］、ISSR［9-10］、AFLP［11］等分子標(biāo)記對(duì)石榴進(jìn)行了遺傳分析，為石榴種質(zhì)資源研究提供分子依據(jù)。目前鮮于利用RAMP(Random am-plified microsatellite polymorphism)標(biāo)記對(duì)石榴進(jìn)行遺傳研究的報(bào)道，RAMP是利用ISSR引物和RAPD引物組合對(duì)基因組進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，其適合遺傳背景尚不清楚的物種的遺傳分析［12］。本研究旨在利用RAMP對(duì)中國(guó)石榴居群進(jìn)行遺傳分析，為石榴資源進(jìn)行有效保護(hù)及可持續(xù)利用提供遺傳信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試46個(gè)石榴品種(表1)采自云南蒙自縣石榴研究所、四川會(huì)理縣農(nóng)業(yè)局石榴品種資源圃。每個(gè)品種從3～5株健壯、無(wú)病蟲(chóng)害石榴樹(shù)采30～50片嫩葉，冰壺運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于－80℃冰箱保存。

表1 供試46個(gè)石榴品種產(chǎn)地、編號(hào)、名稱(chēng)及特性Table 1 Origin，code，cultivar and main characteristics of 46 pomeg ranate cultivars

1.2 DNA 提取

參見(jiàn)趙麗華等［13］改良CTAB法從石榴幼葉中提取基因組DNA，0.80%瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定DNA產(chǎn)量及質(zhì)量，然后將其稀釋為50 ng/μl工作液，放入4℃冰箱里備用。

1.3 引物篩選及PCR擴(kuò)增

引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，由5條ISSR引物和20條RAPD引物組成100對(duì)引物，用3個(gè)形態(tài)差異較大的石榴品種從100對(duì)引物中篩選出DNA條帶清晰、多態(tài)性較高的引物對(duì)(表2)，用選出的多態(tài)性引物對(duì)對(duì)46個(gè)石榴品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;用梯度PCR儀(Eppendorf)確定每對(duì)引物的最適退火溫度。用2.00%瓊脂糖凝膠電泳(含0.1‰GV)分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電壓為2 V/cm，電泳1.5～2.0 h，用紫外與可見(jiàn)分析裝置觀察并拍照記錄。

參照沈潔等［12］PCR 反應(yīng)體系，優(yōu)化 25 μl的PCR反應(yīng)體系為:Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Taq DNA 聚合酶1 U、模板DNA 25 ng、引物各0.15 mmol/L、1×PCR buffer。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;94℃變性45 s，退火(溫度見(jiàn)表2)1 min，72℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。

表2 RAMP引物序列、退火溫度和擴(kuò)增結(jié)果Table 2 List of RAMP primers，annealing temperatures and amplification results

1.4 數(shù)據(jù)處理

將RAMP引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA帶多態(tài)性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置上有帶記錄為“1”，無(wú)帶記錄為“0”，亮度相差2倍的記錄為不同的條帶，建立由“0、1”組成的二元數(shù)據(jù)矩陣。采用 PopGen-1.32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s氏基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon 多樣性指數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離(Dg)、Nei’s遺傳相似系數(shù)(Sg)、遺傳分化系數(shù)(Gst)、基因流(Nm)。

2 結(jié)果

2.1 RAMP 多態(tài)性

14對(duì)RAMP引物對(duì)46個(gè)石榴品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)出127條DNA條帶，平均每條引物擴(kuò)增出8.57條DNA條帶，其中113條顯示多態(tài)性，平均每條引物擴(kuò)增出7.53條多態(tài)性條帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)為88.98%(表2)。14對(duì)RAMP引物擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)為5～15條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為71.43%～100.00%(表2);其中引物對(duì)5'-GTACACACAC-3'+5'-GGTCTACACC-3'擴(kuò)增出的DNA譜帶數(shù)最多，為15條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為80.00%，引物對(duì)5'-GTACACACAC-3'+5'-GGGGTGACGA-3'、5'-GTACACACAC-3'+5'-GGACACCACT-3'、5'-GCACACACAC-3'+5'-AAGACCGGGA-3'、5'-GCTCACTCTCTC-3'+ 5'-GACAGTCCCT-3'和5'-GTTCTCTCTC-3'+5'-TGTGGACTGG-3'擴(kuò)增DNA譜帶多態(tài)性比率均為100.00%。

2.2 居群遺傳多樣性

用PopGen-1.32軟件對(duì)7個(gè)石榴居群DNA譜帶進(jìn)行分析，結(jié)果(表3)顯示:7個(gè)居群多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)分布范圍為32.28% ～65.63%，其中山東居群多態(tài)位點(diǎn)百分率最大，為65.63%，其對(duì)應(yīng)的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)也最大，分別為:1.653 5、1.314 3、0.191 2、0.296 6，表明該居群遺傳多樣性最為豐富;陜西、云南、河南、安徽、四川、新疆多態(tài)位點(diǎn)百分率由大到小依次為:64.57%、62.30%、60.63%、57.48%、36.22%、32.28%，表明各居群遺傳多樣性依次為:山東居群＞陜西居群＞云南居群＞河南居群＞安徽居群＞四川居群＞新疆居群。

表3 居群間遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of pomegranate populations

2.3 居群間的遺傳距離及遺傳分化

用PopGen-1.32對(duì)7個(gè)石榴居群DNA譜帶進(jìn)行分析，得出各居群間的Nei’s遺傳相似系數(shù)(Sg)和遺傳距離(Dg)(表4)顯示，各居群間的Nei’s遺傳相似系數(shù)很高，變化范圍為0.912 0～0.980 6，各居群間的遺傳距離很近，變化范圍為0.019 6～0.092 1。其中山東居群與四川居群的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離為0.092 1，遺傳相似系數(shù)為0.912 0;云南居群與陜西居群親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.980 6，遺傳距離為0.019 6。

表4 7個(gè)石榴居群間的遺傳距離及遺傳相似系數(shù)Table 4 Coefficient of genetic similarity and genetic distance among seven pomegranate populations

7個(gè)石榴居群總基因多樣性系數(shù)(Ht)為0.188 7，居群內(nèi)多樣性系數(shù)(Hs)為0.154 1，遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.183 0，表明分布在居群間的遺傳變異占總遺傳變異的18.30%，居群間遺傳分化較弱;居群間基因流的估測(cè)值(Nm)為2.231 5，Nm＞2，表明居群間存在較強(qiáng)的基因流。

3 討論

居群是生活在一定時(shí)間與空間上的所有同種個(gè)體的總和，是進(jìn)化的基本單位。本研究結(jié)果表明，石榴在中國(guó)7個(gè)主產(chǎn)區(qū)居群的遺傳多樣性依次為:山東居群﹥陜西居群﹥?cè)颇暇尤憨兒幽暇尤憨儼不站尤憨兯拇ň尤憨冃陆尤骸Ｉ綎|居群遺傳多樣性最豐富，其地理位置臨近陜西，從陜西引種后，石榴可能對(duì)山東生態(tài)環(huán)境因子各異的驅(qū)動(dòng)力及人為選擇壓力等因素產(chǎn)生應(yīng)答，在較短的時(shí)間尺度內(nèi)促進(jìn)生物物種的多樣化進(jìn)程［14-15］，因而具有豐富的遺傳多樣性。石榴在陜西的栽培歷史最為悠久，發(fā)生突變、選擇等時(shí)間也較長(zhǎng)，其遺傳多樣性位于其次。由于基因流更容易從遺傳多樣性較高的居群進(jìn)入遺傳多樣性較低的居群［16-17］，因此，山東和陜西可能是中國(guó)石榴傳播中心。

在基因流相關(guān)的適應(yīng)性進(jìn)化和多樣化進(jìn)程中，新的或變化的生態(tài)環(huán)境因子為不同的遺傳來(lái)源提供了新的選擇壓力和適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)會(huì)，一旦種內(nèi)、種間的基因流積極應(yīng)答復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境因子及生態(tài)各異的選擇壓力與驅(qū)動(dòng)力，在較短的時(shí)間尺度內(nèi)也會(huì)促進(jìn)生物物種的適應(yīng)性進(jìn)化和多樣化進(jìn)程［15］。本研究中7個(gè)居群石榴間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.183 0，表明分布在居群間的遺傳變異占總遺傳變異的18.30%，居群內(nèi)遺傳變異占總變異的81.70%，可能是中國(guó)石榴的7個(gè)主栽培區(qū)自然環(huán)境多樣化，為居群內(nèi)變異提供了有利條件，因而遺傳變異主要存在與居群內(nèi)。生物界普遍認(rèn)為居群間基因流(Nm)＞1的基因流就足以抵制居群由遺傳漂變引起的遺傳結(jié)果，維持遺傳變異的多樣性［14，17］，本試驗(yàn)7個(gè)石榴居群間基因流的估測(cè)值(Nm)為2.231 5，表明居群間存在較強(qiáng)的基因流。石榴為異花授粉，從栽培石榴的7個(gè)主產(chǎn)區(qū)地理位置看，花粉傳播形成基因流的可能性很低，應(yīng)主要為人工引種完成遺傳物質(zhì)的遷移，形成基因流，而過(guò)強(qiáng)的基因流可能會(huì)導(dǎo)致當(dāng)?shù)鼗蛐偷耐|(zhì)化或更換，并破壞當(dāng)?shù)匚锓N的適應(yīng)性［18-20］，因此，各地在進(jìn)行引種石榴豐富當(dāng)?shù)剡z傳多樣性時(shí)，同時(shí)要注意地方品種資源的保護(hù)。

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