賈 睿， 杜金梁， 曹麗萍， 徐 跑， 殷國俊

(中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農業(yè)部淡水漁業(yè)和種質資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081)

近年來，魚類肝膽綜合癥、脂肪性肝損傷、化學性肝損傷等疾病在全國很多地區(qū)頻繁發(fā)生，給水產養(yǎng)殖帶來了極大的經濟損失［1-2］。這些疾病的病因多樣，但都破壞肝細胞的正常功能，導致肝細胞破裂，肝組織發(fā)生病變，肝臟功能下降，最終導致魚類的死亡［3］。目前還沒有有效的防治措施。中草藥在水產動物病害防治中的研究已經非常廣泛，漁業(yè)生產實踐證明，中草藥作為混和劑或飼料添加劑適用于當前水產養(yǎng)殖業(yè)的集約化、規(guī)?；a的需要［4］。中草藥制劑在草魚、鰻魚、鱘魚、甲魚等的腸炎防治、免疫力提高中有顯著療效［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，有些中草藥提取物對肝膽綜合癥，化學性肝損傷有一定的治療作用［6-7］。中草藥為天然藥物，毒副作用小，對環(huán)境影響小，不宜在魚體內富集，符合現(xiàn)代人的綠色消費。因此中草藥在水產動物肝損傷防治中的應用將逐漸擴大。

黃芪為豆科紫云英膜莢黃芪及內蒙黃芪的根。廣泛分布于世界溫帶地區(qū)，主要為歐洲、亞洲、南美洲等地。黃芪多糖(APS)為黃芪中主要藥用活性成分，其組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖。在哺乳動物中，黃芪提取物被廣泛的研究，其可提高動物免疫力、改善肝細胞的功能、具有保肝和抗氧化等作用［8-12］。在水產動物中，黃芪提取物可增強鯉、羅非魚的免疫力和抗病菌感染能力［13-14］。

本研究以四氯化碳(CCl4)誘導鯉肝臟組織的急性損傷模型為基礎，通過肝功能生化指標和肝組織病理切片的變化來評價黃芪提取物對鯉急性肝損傷的保護作用，為開發(fā)魚類保肝中草藥配方奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

黃芪提取物購自西安應化生物技術有限公司，有效成分黃芪多糖含量為70%。

谷丙轉氨酶(GPT)活性、谷草轉氨酶 (GOT)活性、乳酸脫氫酶(LDH)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、總蛋白質(TP)含量、白蛋白質(Alb)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)活性等測定試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所科技有限公司。

1.2 試驗設計

試驗所用魚來自于中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場，體質健康無病，規(guī)格基本一致，在循環(huán)水系統(tǒng)中馴養(yǎng)5 d。

將初重為(27.0±1.0)g鯉隨機分為6組，正常組:飼喂普通飼料(粗蛋白40%，粗脂肪10%，灰分10%，能量21 kJ/g，DM)，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射植物油，注射量為0.5 ml/kg;CCl4對照組:飼喂普通飼料(粗蛋白40%，粗脂肪10%，灰分10%，能量21 kJ/g，DM)，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射30%CCl4混合液(CCl4∶植物油=3∶7)，注射量為0.5 ml/kg;藥物對照組:飼喂含3.0 g/kg黃芪提取物的飼料，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射植物油，注射量為0.5 ml/kg;1.0 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7)，每10 g魚注射0.05 g CCl4-植物油混合液;1.5 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7)，每10 g魚注射0.05g CCl4-植物油混合液;3.0 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7)，每10 g魚注射0.05 g CCl4-植物油混合液，每組15條魚。每天飼喂2次，每次投喂飼料量為魚體重的2%左右。72 h后抽血并采集肝組織。

1.3 肝組織勻漿制備

將抽完血的魚進行解剖，取其肝臟組織，用預冷的生理鹽水漂洗去血液，剪去肝臟表面附著的結締組織，再用濾紙吸去表面水分，稱重，用眼科剪刀剪碎，移入勻漿管中，加入0.86%生理鹽水進行勻漿，生理鹽水的總體積是組織塊質量的9倍。將制備好的10.00% 的勻漿用普通離心機2 000 r/min離心15 min收集上清液，備用。

1.4 生化指標活力測定與組織病理學觀察

生化指標活力測定:按照試劑盒操作說明分別測定血清生化參數(shù)(GPT活性、GOT活性、LDH活性、Alb含量和TP含量);肝勻漿生化參數(shù)(SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性、T-AOC、GSH 含量和MDA含量)。

組織病理學觀察:將采集的鯉肝組織用10.00%的甲醛固定，制作常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察并拍照。

1.5 測定指標的計算

特定生長率(SGR)=(lnWt－lnW0)/t×100%

餌料系數(shù)(FC)=FI/(Wt-W0)

肝指數(shù)(LI)=Wl/Wb×100%

脾指數(shù)(SI)=Ws/Wb×100%

式中，W0為魚初體均重(g);Wt為魚末體均重(g);t為飼喂天數(shù)(d);FI每尾魚平均攝食飼料總量(風干樣重)(g);Wl為每尾魚末肝臟重 (g);Ws為每尾魚末脾臟重(g);Wb為每尾魚末體重(g)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0軟件包中的單因素方差分析(One-way-ANOVA)處理，對樣本之間進行t檢驗。

2 結果

2.1 黃芪提取物對鯉生長性能的影響

由表1可見，用含黃芪提取物飼料飼喂鯉60 d后，隨黃芪提取物濃度的增加，鯉特定生長率有升高的趨勢，其飼料系數(shù)呈下降趨勢，但與正常組相比，2項指標均未達到顯著性差異。表明黃芪提取物沒有有效地促進鯉生長性能(P＞0.05)。

表1 黃芪提取物對鯉特定生長率和餌料系數(shù)的影響Table 1 Effects of ARE on specific growth rates and feed coefficients of carps

2.2 黃芪提取物對鯉肝和脾指數(shù)的影響

由表2可知，CCl4對照組鯉肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著高于正常組(P ＜0.05)，而在1.0 g/kg、1.5 g/kg、3.0 g/kg黃芪提取物中這2種指數(shù)均低于CCl4對照組，其中3.0 g/kg黃芪提取物組中肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著低于CCl4對照組(P＜0.05)。

表2 黃芪提取物對CCl4致鯉肝和脾指數(shù)的影響Table 2 Effects of ARE on liver and spleen indexes of CCl4-treated carps

2.3 黃芪提取物對鯉血清中生化指標的影響

圖1結果顯示，CCl4對照組鯉血清中谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性均顯著或極顯著高于正常組(P＜0.01或P＜0.05)，GPT升高4倍左右，GOT升高3倍左右，表明CCl4嚴重損傷鯉肝組織。相對于 CCl4組，1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組鯉血清中GPT、GOT和LDH活性均顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。與正常組相比較，CCl4對照組鯉血清中總蛋白質(TP)含量顯著下降(P＜0.05)，白蛋白質(Alb)含量極顯著下降(P＜0.01)。1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組鯉血清中TP和Alb含量均顯著高于CCl4對照組(P＜0.05)。

圖1 黃芪提取物對CCl4致鯉肝損傷血清中GPT活性、GOT活性、LDH活性、總蛋白質含量和白蛋白質含量的影響Fig.1 Effects of ARE on the activities of GPT，GOT and LDH and the contents of TP and Albumin in the serum of CCl4-treated carps

2.4 黃芪提取物對鯉肝組織勻漿中生化指標的影響

CCl4對照組鯉肝組織抗氧化指標［超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、和總抗氧化能力(TAOC)］均顯著低于正常組(P＜0.05)(圖2)，表明CCl4顯著地破壞了鯉肝組織中的抗氧化系統(tǒng)。1.0 g/kg、1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性和T-AOC均不同程度地高于CCl4對照組，其中1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組SOD活性和T-AOC均顯著高于CCl4對照組(P＜0.05)，3.0 g/kg黃芪提取物組GSH-Px和CAT均顯著高于CCl4對照組(P＜0.05)(圖2)。

與正常組相比，CCl4對照組鯉肝組織谷胱甘肽(GSH)含量顯著下降(P＜0.05)，丙二醛(MDA)含量顯著增加(P＜0.05)(圖2)。1.5 g/kg和 3.0 g/kg黃芪提取物組GSH含量顯著高于CCl4對照組(P＜0.05);3.0 g/kg黃芪提取物組MDA含量顯著低于CCl4對照組(P＜0.05)。

圖2 黃芪提取物對CCl4致鯉肝損傷組織中SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性、總抗氧化能力、GSH含量和MDA含量的影響Fig.2 Effects of ARE on the activities of SOD，GSH-Px，CAT，and the contents of T-AOC，CSH and MDA in the liver of CCl4-treated carps

2.5 黃芪提取物對鯉肝組織形態(tài)學的影響

由圖3可知，正常組鯉肝細胞輪廓清晰，細胞大小基本一致，細胞核突出、呈球形、位于細胞中央，并且能觀察到細胞核中的核仁;CCl4對照組鯉肝細胞中細胞核變小、固縮、側移，有的細胞質細胞核消失，出現(xiàn)空泡，細胞之間發(fā)生融合;飼喂黃芪提取物的肝組織切片中保護程度和其濃度相關，在1.0 g/kg黃芪提取物組中，有很多細胞之間發(fā)生融合，細胞核變小、側移，空泡較多;1.5 g/kg黃芪提取物組中，細胞肝損傷程度變小，細胞數(shù)量增多，空泡減少，細胞形態(tài)多為圓形，細胞膜清晰可見;而在3.0 g/kg黃芪提取物組中，其損傷程度明顯降低，細胞核位于細胞中心，細胞與細胞之間的邊界清晰可見。

圖3 黃芪提取物對鯉肝組織損傷的影響(HE染色，×200)Fig.3 Effects of ARE on carp liver injury induced by CCl4

3 討論

四氯化碳(CCl4)是一種經典的肝臟毒物，被廣泛的用來構建肝(細胞)損傷模型來研究肝損傷機理和篩選保肝藥物［7，15］。CCl4在肝細胞內經過代謝產生·CCl3自由基，作用于細胞后，和膜上的不飽和脂質共價結合，致使脂質過氧化，引起肝細胞的壞死［16］，其機理為:CC14經 CYP450 亞族 CYP450 2E1活化后生成三氯甲基自由基(·CC13)，并在其啟動的過氧化連鎖反應中，產生毒性作用更強的二氯甲基自由基 (·CC12)及過氧化甲基自由基(·OOCC1)［17］。與哺乳動物一樣，魚類肝細胞對CCl4也比較敏感［18］，對虹鱒的研究結果表明，CCl4致使肝組織損傷，引起LDH大量的釋放和GSH含量的降低，并且這些變化呈劑量依賴性［19］。進一步研究結果表明CCl4會抑制肝組織和腎組織中抗氧化酶基因的表達［20］。

本研究結果顯示，黃芪提取物對鯉肝組織沒有毒性作用。當鯉腹部注射CCl4后，肝臟和脾臟直接暴露在毒物中，CCl4形成的自由基嚴重地損傷了鯉肝組織和脾組織，導致其水腫和局部腐爛，因此肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著高于正常組。用黃芪提取物飼喂的鯉肝指數(shù)和脾指數(shù)均低于CCl4組，當黃芪提取物濃度到達3.0 g/kg時，肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低，表明黃芪提取物有效地抑制了CCl4引起的鯉肝組織損傷。

肝細胞受到損傷后，細胞膜通透性增強，細胞內的可溶性酶GPT、GOT和LDH溢出量顯著增高［21］。這3種酶是肝細胞是否損傷的經典指標，是存在于肝細胞漿內的可溶性酶，其活性變化亦是反映肝細胞受損傷的主要敏感指標［22］。本試驗中，CCl4組鯉肝組織中GPT、GOT和LDH活性顯著高于正常組;飼喂黃芪提取物組鯉肝組織GPT、GOT和LDH活性均顯著低于CCl4組，而TP和Alb含量均顯著高于CCl4組。Yan等［23］在對小鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)，黃芪提取物能抑制肝損傷。據(jù)推測這可能與黃芪提取物中多糖對細胞膜修復作用相關［24］。

脂質過氧化是機體氧化應激的重要指標，MDA是脂質過氧化的主要產物，其含量的高低可反映機體脂質過氧化程度［21］。CCl4做為一種肝臟毒物可促進組織中自由基的增長和脂質過氧化［25］，引起MDA含量的升高;段薈等［26］研究結果顯示，黃芪提取物可抑制MDA的上升，提示黃芪提取物同時可通過抑制自由基和脂質過氧化物的產生，而起到對肝損傷細胞的保護作用。本試驗中，CCl4組鯉肝組織MDA含量顯著增加，而在黃芪提取物組中MDA生成被不同程度地抑制，其中3.0 g/kg黃芪提取物組MDA含量顯著降低，表明黃芪提取物能有效抑制鯉肝組織脂質過氧化。

研究結果表明，藥物保肝作用主要與其抗氧化能力和清除自由基能力有關［27］。機體抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、GSH-Px、CAT)為防自由基損傷的第一道防線，這些酶活性的降低表明自由基含量的升高［28］;T-AOC反應了機體防御體系的抗氧化能力的強弱，包含了酶促和非酶促2個抗氧化反應體系，是機體抗氧化物質含量高低的可靠指標［29］。本試驗結果顯示，CCl4致使鯉肝組織損傷，引起SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性和T-AOC降低，而用黃芪提取物飼喂后的鯉肝中4種生化指標均提高，表明黃芪提取物能增強鯉抗氧化能力。同樣，Shen等［30］也發(fā)現(xiàn)黃芪提取物能提高小鼠體內SOD活性。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪提取物中黃芪多糖能夠增強機體的抗氧化能力，提高清除自由基的能力［12］。

GSH是一種生物體內最豐富的三肽非酶類抗氧化物，可直接消除活性氧自由基，同時作為谷胱甘肽過氧化物酶的底物，在清除細胞內過氧化氫及脂過氧化物中發(fā)揮作用［31］。本試驗結果顯示，CCl4引起鯉肝組織中GSH大量的消耗，而黃芪提取物顯著抑制GSH的消耗。在對小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪提取物能增強機體GSH含量［26］，這與本研究結果相符。

本研究結果顯示，黃芪提取物對鯉肝組織的保護效果呈劑量依賴性，3.0 g/kg黃芪提取物的保護效果最好。從本研究結果推測，黃芪提取物對鯉肝組織的保護作用與其增強機體的抗氧化能力、促進蛋白合成、抑制GSH消耗和MDA生成等有關。

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