劉曉青， 蘇家樂， 陳尚平， 李 暢， 項(xiàng)立平， 何麗斯

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇 南京 210014)

高山杜鵑是杜鵑花科杜鵑花屬中常綠闊葉類杜鵑以及其雜交后代的總稱［1］，其花序碩大、花團(tuán)錦簇、花瓣晶瑩剔透、葉色四季常青，具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，深受人們的喜愛，是高檔的年宵花卉和園林綠化植物，具有廣闊的市場(chǎng)開發(fā)前景［2］。由于高山杜鵑枝粗葉少，扦插生根十分困難，為滿足高山杜鵑與日俱增的市場(chǎng)需求量，組織培養(yǎng)作為高山杜鵑優(yōu)良品種高效繁殖的重要手段越來越受到重視［3］。光源是組織培養(yǎng)中最重要的實(shí)驗(yàn)因子之一，為植物光合作用提供輻射能，還為植物提供信號(hào)調(diào)節(jié)。新型LED(Light emitting diodes)光源具有波長(zhǎng)具體、波普寬度小、光譜性能好、光效高、壽命較長(zhǎng)、節(jié)能等一系列傳統(tǒng)電光源技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為植物組織培養(yǎng)研究的重要光源之一［4］。目前，國(guó)內(nèi)外已有部分研究將LED光源應(yīng)用到組織培養(yǎng)上［5-7］，但LED光源對(duì)高山杜鵑葉片再生的研究未見報(bào)道。本研究采用LED光源發(fā)射的單色光譜紅光(630 nm)和藍(lán)光(445 nm)，進(jìn)行不同光質(zhì)配比組合，研究高山杜鵑葉片再生及試管苗生長(zhǎng)對(duì)不同LED光質(zhì)組合的響應(yīng)特征，以期為新型LED光源在組織培養(yǎng)中的應(yīng)用和推廣提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為高山杜鵑品種粉金蝶(Rhododendron hybrids‘Cosmopolitan’)的組織培養(yǎng)無菌苗。

1.2 培養(yǎng)基

葉片再生培養(yǎng)基:WPM+1.0 mg/L噻苯隆 +0.5 mg/L吲哚丁酸+30.0 g/L蔗糖。

生根培養(yǎng)基［3］:1/2 WPM+0.25 mg/L 萘乙酸+0.25 mg/L吲哚丁酸+15.00 g/L蔗糖。

以上培養(yǎng)基在調(diào)pH值為5.2～5.7后，添加瓊脂6 g/L，經(jīng)高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

將無菌苗從培養(yǎng)瓶中取出，并在超凈工作臺(tái)上將其葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，以葉片遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基的方式將其接種到葉片再生培養(yǎng)基上，先經(jīng)過14 d的黑暗培養(yǎng)，然后分別置于不同的光質(zhì)(表1)處理下培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)相關(guān)指標(biāo)，每種光質(zhì)下處理50塊葉片。

表1 不同LED光質(zhì)的主要技術(shù)參數(shù)Table 1 Major technical parameters of different LED light treatments

待各種光質(zhì)處理下形成的不定芽生長(zhǎng)至0.5～1.0 cm時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯的不定芽并在超凈工作臺(tái)上將其切下，接種到生根培養(yǎng)基中，置于原光質(zhì)下培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)相關(guān)指標(biāo)，每種光質(zhì)下處理50株不定芽。

培養(yǎng)室溫度為(23±2)℃，1 d光照時(shí)間為12 h，光照度為 50 μmol/(m2·s)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及數(shù)據(jù)分析

在再生培養(yǎng)基中結(jié)束培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)不定芽再生率、再生芽數(shù);在生根培養(yǎng)基中結(jié)束培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)植株的生根率、株高、葉片數(shù)、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、生根率、葉片色素含量和根系活力［8］等指標(biāo)，其中葉長(zhǎng)和葉寬是統(tǒng)計(jì)植株倒5葉的長(zhǎng)和寬。

數(shù)據(jù)分析和制圖采用Excel 2003和SPSS 13.0分析軟件進(jìn)行，同類型數(shù)據(jù)顯著性差異運(yùn)用Duncan’s檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑葉片再生的影響

不同LED光質(zhì)配比處理的高山杜鵑葉片不定芽再生情況(表2)顯示，紅藍(lán)光組合(3∶1)處理的高山杜鵑葉片不定芽再生效果最好，其葉片不定芽再生率比熒光燈處理(對(duì)照)的高出9.1個(gè)百分點(diǎn)(P＜0.05)，平均再生芽數(shù)比對(duì)照多3.9個(gè)(P＜0.05)。100%藍(lán)光處理下高山杜鵑葉片不定芽再生效果最差。紅藍(lán)光組合(3∶1、2∶1和1∶1)處理的高山杜鵑葉片不定芽再生效果均顯著好于100%紅光和藍(lán)光(P＜0.05)，表明紅藍(lán)光組合配比處理對(duì)葉片不定芽的分化起促進(jìn)作用。

表2 不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑葉片再生不定芽的影響Table 2 Effects of different combinations of red light and blue light on the shoot regeneration from Rhododendron leaf

2.2 不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑試管苗生長(zhǎng)的影響

從表3可以看出，不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑試管苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的影響均存在一定的差異。其中，100%紅光處理下植株的株高、葉長(zhǎng)和葉寬均顯著高于對(duì)照，莖粗顯著低于對(duì)照，說明100%紅光處理下植株有一定的徒長(zhǎng)現(xiàn)象。100%藍(lán)光處理植株的株高顯著低于其他處理，莖粗顯著高于其他處理(除了對(duì)照)，干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均較小;紅藍(lán)光組合(3∶1、2∶1和1∶1)處理下的植株生長(zhǎng)茂盛，株高、葉片數(shù)、葉長(zhǎng)和葉寬均高于熒光燈對(duì)照，且以紅藍(lán)光組合(3∶1)的效果好，其株高、葉片數(shù)和葉寬均顯著高于對(duì)照。以上分析表明，紅藍(lán)復(fù)色光更有利于高山杜鵑試管苗的形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育，尤其以較高的紅光比例為好。

表3 不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑試管苗生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of different combinations of red light and blue light on the growth of Rhododendron seedlings in vitro

2.3 不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑試管苗葉片色素含量的影響

由表4可知，紅藍(lán)光組合處理下的試管苗葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b均顯著高于對(duì)照;類胡蘿卜素含量在各個(gè)處理之間差異不顯著;100%紅光處理下的葉綠素a/b值最高，其次是熒光燈對(duì)照，3種紅藍(lán)光組合的葉綠素a/b值均顯著低于100%紅光處理和熒光燈對(duì)照。

表4 不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑試管苗葉片色素含量的影響Table 4 Effects of different combinations of red light and blue light on the pigment contents of Rhododendron seedlings in vitro

2.4 不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑試管苗根系生長(zhǎng)的影響

圖1是不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑試管苗生根率和根系活力的影響。結(jié)果顯示，100%紅光處理下試管苗生根率最高，為100%，但其根系活力最低;而100%藍(lán)光處理下試管苗生根率顯著低于其他處理，比對(duì)照少20.7個(gè)百分點(diǎn)，但其根系活力最強(qiáng)。3種紅藍(lán)光組合處理下的生根率和根系活力與熒光燈對(duì)照均無顯著差異，這表明紅藍(lán)復(fù)色光對(duì)試管苗根系生長(zhǎng)無不良影響。由此可以看出，對(duì)于生根比較困難的試管苗，在前期可以用紅光進(jìn)行生根誘導(dǎo)，而在后期適當(dāng)?shù)奶砑铀{(lán)光能增加根系活力。

圖1 不同LED光質(zhì)配比對(duì)高山杜鵑試管苗生根率(A)和根系活力(B)的影響Fig.1 Effects of different combinations of red light and blue light on the rooting rate and root vigor of Rhododendron seedlings in vitro

3 討論

光質(zhì)是影響試管苗生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因素之一，對(duì)植株的形態(tài)建成、生理代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等都有著重要的調(diào)節(jié)作用。在植物體內(nèi)的色素中主要有2種色素(光敏色素和隱花色素)在調(diào)節(jié)植物對(duì)光的反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用，這2種色素分別對(duì)610～700 nm紅光和425～490 nm藍(lán)光有較強(qiáng)的吸收作用［6］。因此，LED紅光、LED藍(lán)光及其不同配比的組合光質(zhì)成為目前組織培養(yǎng)中新型光源的研究熱點(diǎn)［9-11］。秦永華等［12］研究了不同有色膜對(duì)草莓葉片再生的影響，認(rèn)為綠膜和紅膜對(duì)不定芽再生有明顯的促進(jìn)作用，而藍(lán)膜和黃膜則不利于芽的分化;周厚成等［13］等研究結(jié)果表明，紅膜、綠膜、黃膜均能顯著提高草莓葉片再生率，而藍(lán)膜對(duì)再生率無影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與熒光燈對(duì)照相比，單色紅光或藍(lán)光對(duì)高山杜鵑葉片不定芽再生率均有顯著的抑制作用，而紅藍(lán)光組合配比更利于高山杜鵑葉片不定芽的形成，這可能是因?yàn)榧t藍(lán)光結(jié)合更有利于光合色素對(duì)光的響應(yīng)，從而更好的調(diào)節(jié)激素水平而影響不定芽的分化。

本研究結(jié)果表明，單色紅光處理下的高山杜鵑試管苗植株細(xì)高、葉片較細(xì)長(zhǎng)，有一定的徒長(zhǎng)現(xiàn)象;單色藍(lán)色處理下的植株莖干較粗，株高最矮，葉片數(shù)目最少;而較高比例的紅藍(lán)復(fù)色光組合(3∶1)處理下，植株形態(tài)較正常，且植株的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均比對(duì)照高，這與Poudel等［14］報(bào)道的紅光和藍(lán)光組合處理后試管苗生長(zhǎng)健壯等結(jié)果一致，相似的結(jié)果也出現(xiàn)在冬青［15］、番茄［16］、油菜［17］的研究中。

葉綠素含量是光合能力的重要指標(biāo)，類胡蘿卜素保護(hù)葉綠素免受光氧化，增強(qiáng)其抗光抑制能力［18］。在本研究中，紅藍(lán)光組合處理下的高山杜鵑試管苗葉片葉綠素含量顯著高于對(duì)照，這表明LED復(fù)色光不僅不會(huì)對(duì)高山杜鵑試管苗植株色素的形成、葉綠素的發(fā)育等造成影響，反而對(duì)色素的合成有一定的促進(jìn)作用，這與邸秀茹等［19］在菊花的研究中發(fā)現(xiàn)單色藍(lán)光處理下葉綠素含量最高的結(jié)果不一致，而與戴艷嬌等［20］在蝴蝶蘭中的研究結(jié)果相一致，這可能的原因是紅光促進(jìn)植株葉片的生長(zhǎng)但降低了葉綠素的含量，而紅藍(lán)光組合與光敏色素和隱花色素的交互作用更利于植物對(duì)光的響應(yīng)［21］。

植物根系是最主要的吸收器官和合成器官之一，其活力的強(qiáng)弱與植株地上部分的生長(zhǎng)和發(fā)育密切相關(guān)。蒲高斌等［22］在番茄的研究中發(fā)現(xiàn)藍(lán)光處理下植株根系活力高，植株健壯。本研究發(fā)現(xiàn)，高山杜鵑試管苗在藍(lán)光處理下根系活力高，但植株的生根率較低，而紅光處理下植株生根率較高，但根系活力弱，這說明藍(lán)光在提高植株根系活力的同時(shí)抑制試管苗生根，而紅光對(duì)試管苗生根誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用［5，23］。因此，對(duì)于組織培養(yǎng)生根比較困難的高山杜鵑，可以在生根培養(yǎng)前期適當(dāng)?shù)脑黾蛹t光以誘導(dǎo)根系形成，而在后期適當(dāng)?shù)脑黾铀{(lán)光的比例，以促進(jìn)根系的健壯生長(zhǎng)，提高根系活力［15］。

復(fù)合LED光質(zhì)對(duì)試管苗生長(zhǎng)的效果優(yōu)于熒光燈光質(zhì)，其能效是熒光燈的3～9倍，且壽命長(zhǎng)，突顯了LED用于植物組培和工廠化快繁育苗產(chǎn)業(yè)的高能效特征，是替代熒光燈的理想光源［15］。本研究試驗(yàn)結(jié)果與大部分研究者的結(jié)論類似或一致，這證明了LED光質(zhì)對(duì)植株的形態(tài)建成和生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的影響，并通過研究高山杜鵑組織培養(yǎng)中葉片再生和試管苗生長(zhǎng)對(duì)不同光質(zhì)配比組合的響應(yīng)特點(diǎn)，為組織培養(yǎng)上利用LED光源提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

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