徐小波， 陳 哲， 章熙霞， 袁詠剛， 王 秀， 邢光東， 方津津

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014;2.南京市畜牧家禽科學(xué)研究所，江蘇 南京 210036)

在養(yǎng)豬業(yè)中，繁殖性狀具有重要經(jīng)濟(jì)價值，但繁殖性狀的遺傳力較低，傳統(tǒng)的表型選擇效果不理想，因此國內(nèi)外學(xué)者紛紛轉(zhuǎn)向?qū)ふ遗c繁殖性狀關(guān)聯(lián)的基因或者分子標(biāo)記［1］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾十個豬繁殖相關(guān)數(shù)量性狀位點(QTLs)，如雌激素受體(ESR)基因［2］、催乳素受體(PRLR)基因［3］和促卵泡素 β 基因(FSHβ)［4］等，這些基因都不同程度地影響豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)以及初生質(zhì)量等繁殖性狀。

ESR、PRLR和 FSHβ基因在民豬、金華豬等地方豬種和長白、大白等國外豬種中都有報道，但尚未見在山豬中的報道。山豬是江蘇省畜禽遺傳資源保護(hù)品種，主要分布于寧鎮(zhèn)揚等丘陵山區(qū)，具有瘦肉率高、肉質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)仔數(shù)多、體質(zhì)好、抗病抗逆性強等優(yōu)良特性。由于上世紀(jì)外來豬種的大力推廣，山豬被人為棄養(yǎng)，目前純種山豬數(shù)量較少，盡快挖掘山豬繁殖性狀遺傳優(yōu)勢并應(yīng)用于育種工作，已經(jīng)是迫在眉睫。本試驗研究ESR、PRLR和FSHβ基因多態(tài)性對山豬繁殖性狀的效應(yīng)，以期為山豬的遺傳資源保存和分子標(biāo)記輔助選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗豬群

試驗豬為南京市畜牧家禽研究所試驗豬場山豬育種核心群二胎以上經(jīng)產(chǎn)母豬60頭，所有種豬均有清晰的系譜和每窩產(chǎn)仔哺育記錄，仔豬斷奶時間為35 d。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要試劑 PCR擴(kuò)增引物合成及DNA測序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成;DNA回收純化試劑盒和小量質(zhì)粒純化試劑盒均購自天根生化科技有限公司;Premix Ex Taq聚合酶、pMD18-T Vector等均購自大連寶生物公司;限制性內(nèi)切酶均購自北京NEB公司。

1.2.2 DNA提取 活體采樣，用耳號鉗取耳組織樣約10 mg浸泡在裝有70%乙醇的EP管內(nèi)，－20℃凍存。采用苯酚法提取DNA。

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計 ESR［5］、PRLR［6］和 FSHβ［4］基因多態(tài)位點引物(表 1)經(jīng)去離子水溶解后，－20℃保存待用。

表1 候選基因引物序列Table 1 Primers designed for candidate genes

1.2.4 PCR擴(kuò)增體系 PCR反應(yīng)總體系25.0 μl，Premix Ex Taq 12.5 μl，上、下 游 引 物 (100 μmol/L)各 0.5 μl，模板 DNA 1.0 μl，加滅菌雙蒸水至總反應(yīng)體積25.0 μl。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性 30 s，Tm復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后置于4℃保存。

1.2.5 酶切反應(yīng) 除FSHβ基因擴(kuò)增產(chǎn)物直接電泳外，ESR和PRLR基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別用PvuⅡ和AluⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系:2.0 μl 10 ×NEB 緩沖液，0.2 μl 100 ×BSA，0.5 μl內(nèi)切酶，PCR 產(chǎn)物 5.0 μl，加超純水至 20.0 μl。酶切反應(yīng)條件37℃，反應(yīng)時間4～6 h。

1.3 統(tǒng)計分析

利用POPGENE1.32軟件計算基因型和等位基因頻率，并進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡性檢驗。采用統(tǒng)計模型Y=μ+α+e分析基因型對性狀的效應(yīng)，其中Y為性狀值，μ為總體平均數(shù)，α為基因型效應(yīng)值，e為隨機誤差。

2 結(jié)果

2.1 ESR、PRLR和FSHβ基因在山豬中的基因型和等位基因頻率

ESR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度120 bp，酶切后出現(xiàn)多態(tài)性(圖1)，出現(xiàn)120 bp條帶的為AA型，出現(xiàn)65 bp和55 bp的為BB型，同時出現(xiàn)120 bp、65 bp和55 bp的為AB型。

圖1 山豬ESR基因PCR-RFLP檢測Fig.1 PCR-RFLP of ESR gene in Shan pig

PRLR基因PCR產(chǎn)物長170 bp，AluⅠ酶切后出現(xiàn)多態(tài)性(圖2)，同時出現(xiàn)85 bp、59 bp和19 bp 3條條帶的為AA型，出現(xiàn)104 bp和59 bp的為BB型，同時出現(xiàn)104 bp、85 bp、59 bp和19 bp 4條條帶的為AB型。

圖2 山豬PRLR基因PCR-RFLP檢測Fig.2 PCR-RFLP of PRLR gene in Shan pig

FSHβ基因是由于插入了一個長度為292 bp的逆轉(zhuǎn)座子造成該基因位點的多態(tài)性，PCR產(chǎn)物只出現(xiàn)500 bp條帶的為AA型，只出現(xiàn)220 bp的為BB型，同時出現(xiàn)500 bp和220 bp的AB型(圖3)。

圖3 山豬FSHβ基因PCR電泳檢測Fig.3 PCR of FSHβ gene in Shan pig

山豬ESR、PRLR和FSHβ基因的基因型和基因頻率分布見表2。經(jīng)卡方測驗，山豬群體內(nèi)ESR各基因型分布不符合哈迪-溫伯格平衡(P＜0.05);PRLR各基因型的分布符合哈迪-溫伯格平衡(P＞0.05);FSHβ基因只發(fā)現(xiàn)AA型和AB型2種基因型，沒發(fā)現(xiàn)BB型，其中AA基因型頻率最高，為0.567，不符合哈迪－溫伯格平衡(P＜0.05)。ESR基因的A等位基因頻率低于B等位基因頻率，F(xiàn)SHβ和PRLR基因的A等位基因頻率均高于B等位基因頻率。

表2 ESR、PRLR和FSHβ基因的基因型頻率和等位基因頻率分布Table 2 Gene and genotype frequencies of ESR，PRLR and FSHβ genes in Shan pig

2.2 ESR、PRLR和FSHβ基因多態(tài)性與山豬產(chǎn)仔性能

分別統(tǒng)計ESR、PRLR和FSHβ基因各基因型頭胎和二胎的總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)和產(chǎn)活仔數(shù)(NBA)見表3。ESR基因BB型是產(chǎn)仔性能優(yōu)勢基因型，BB型個體的頭胎及二胎的TNB和NBA均顯著高于AB型(P＜0.05)和AA型(P＜0.01);AB型的頭胎NBA顯著高于 AA型(P＜0.05)，二胎的 TNB和NBA均顯著高于AA型(P＜0.01)。PRLR基因AA型為有利基因型，其效應(yīng)為AA＞AB＞BB，AA型和AB型頭胎和二胎的TNB和NBA均極顯著高于BB型(P＜0.01)，AA型和AB型之間差異不顯著(P＞0.05)。FSHβ基因在山豬群體內(nèi)只有AA型和AB型，AA型頭胎TNB和NBA及二胎NBA均顯著高于AB型(P＜0.05)，AA型二胎TNB極顯著高于AB型(P＜0.01)。

表3 ESR、PRLR和FSHβ基因不同基因型的總產(chǎn)仔數(shù)與產(chǎn)活仔數(shù)Table 3 Total number of born and number of born alive of pigs with different genotypes of ESR，PRLR and FSHβ genes

2.3 ESR、PRLR和FSHβ基因多態(tài)性與仔豬初生質(zhì)量、斷奶質(zhì)量的關(guān)系

分別統(tǒng)計ESR、PRLR和FSHβ基因各基因型頭胎和二胎產(chǎn)仔的初生質(zhì)量(BW)和斷奶質(zhì)量(WW)見表4?？梢?，ESR基因AA型是仔豬體質(zhì)量優(yōu)勢基因型，對BW性狀，其效應(yīng)排序為AA＞BB＞AB;對WW性狀，其效應(yīng)排序為AA＞AB＞BB;具體表現(xiàn)為AA型的頭胎和二胎的BW均顯著高于AB和BB型(P＜0.05);AA型的頭胎和二胎的WW顯著高于BB型(P＜0.05)。PRLR基因BB型為仔豬體重優(yōu)勢基因型，對BW和WW性狀，其效應(yīng)排序均為BB＞AB＞AA;其中BB型頭胎和二胎仔豬的WW均顯著高于 AA型(P＜0.05)，其余差異不顯著(P＞0.05)。FSHβ基因只有AA型和AB型，AB型頭胎和二胎BW和WW均高于AA型(P＞0.05)。

表4 ESR、PRLR和FSHβ基因不同基因型的初生質(zhì)量和斷奶質(zhì)量Table 4 Birth weight and weaning weight of pigs with different genotypes of ESR，PRLR and FSHβ genes

3 討論

3.1 各候選基因多態(tài)性及群體遺傳分析

陳克飛等［7］研究發(fā)現(xiàn)ESR基因的B等位基因在國內(nèi)豬種占優(yōu)勢(0.73)，而國外豬種內(nèi)A等位基因頻率較高(0.66)。在山豬群體中，本研究得到與以往結(jié)論相同的結(jié)果。趙要風(fēng)等［4］在二花臉和香豬內(nèi)只發(fā)現(xiàn)了FSHβ基因的 A等位基因，徐寧迎等［8］在金華豬Ⅰ系內(nèi)發(fā)現(xiàn) B等位基因頻率極低(0.012)，在Ⅱ系和Ⅲ系內(nèi)只發(fā)現(xiàn)A等位基因。本研究中未發(fā)現(xiàn)FSHβ基因的BB基因型，B等位基因頻率為0.22。就PRLR基因而言，本研究所得結(jié)果與李婧等［9］的研究結(jié)果一致。群體的遺傳平衡檢測結(jié)果表明，山豬并未處于穩(wěn)定遺傳平衡狀態(tài)。

3.2 各候選基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性

ESR基因是較早發(fā)現(xiàn)的豬產(chǎn)仔數(shù)性狀主效基因，許多研究認(rèn)為每個B等位基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)的效應(yīng)為0.3 ～1.5 頭/胎［2，10-11］。對地方豬種姜曲豬、小梅山豬及二花臉豬的研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因?qū)偖a(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的效應(yīng)均達(dá)到極顯著水平，每個B等位基因?qū)偖a(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的加性效應(yīng)分別為1.52和 1.50頭/胎［10］。本研究中，山豬群體 ESR基因BB型是優(yōu)勢基因型，B等位基因頻率達(dá)到0.817，與大多數(shù)國內(nèi)豬種的報道比較一致［7］。同時本研究發(fā)現(xiàn)ESR基因BB基因型個體頭胎和二胎的總產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)均顯著高于AA型個體(P＜0.01)。推測山豬與其他地方豬種一樣有較高的繁殖性能的潛力。

趙要風(fēng)等［4］提出FSHβ是控制豬產(chǎn)仔性狀主效基因，AA基因型是國內(nèi)豬種的優(yōu)勢基因型，可以明顯提高產(chǎn)仔數(shù)［4，9，12］，但 Korwin-Kossakowska 等［13］報道中FSHβ基因的作用卻是不顯著的。本研究的山豬群體內(nèi)，B等位基因頻率很低，和其他國內(nèi)地方豬種的基因分布趨勢相近［11-12，14］，但本研究發(fā)現(xiàn) AA型的頭胎和二胎的總產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)均略高于AB型，A等位基因是優(yōu)勢基因。由于本試驗未發(fā)現(xiàn)BB型個體，可能由于山豬遺傳資源嚴(yán)重流失導(dǎo)致，因此FSHβ基因?qū)ι截i繁殖性狀的作用有待后期繼續(xù)測定。

國內(nèi)外不同學(xué)者對不同豬種的研究發(fā)現(xiàn)PRLR基因與產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)，A等位基因能顯著提高產(chǎn)仔數(shù)［15-16］;另一部分研究者則認(rèn)為BB基因型對豬產(chǎn)仔數(shù)更有利［6，17］。前人的研究成果說明PRLR多態(tài)性與繁殖性能存在相關(guān)性，但其在不同豬種中的多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)系尚無定論。本研究與李婧等［11］的研究結(jié)果一致，PRLR基因的A等位基因為優(yōu)勢等位基因，AA基因型產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于BB基因型個體。

3.3 各候選基因多態(tài)性與初生質(zhì)量、斷奶質(zhì)量的相關(guān)性

關(guān)于ESR、PRLR和FSHβ基因?qū)ψ胸i初生質(zhì)量和斷奶質(zhì)量的影響，目前還沒有定論。部分研究認(rèn)為ESR、PRLR和FSHβ基因?qū)ψ胸i初生質(zhì)量和斷奶質(zhì)量沒有顯著影響［18-19］，但是胡雪松等［20］發(fā)現(xiàn)，PRLR基因?qū)鴥?nèi)豬種和國外豬種初生質(zhì)量作用顯著不同。本研究中，PRLR基因?qū)︻^胎和二胎仔豬的斷奶質(zhì)量效應(yīng)顯著，ESR基因?qū)︻^胎、二胎的初生質(zhì)量和斷奶質(zhì)量均有顯著影響。謝保勝［21］的研究結(jié)果表明，金華豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)與初生質(zhì)量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，本研究中，山豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)與初生質(zhì)量的遺傳關(guān)系也有相似趨勢。這一結(jié)果為山豬的分子標(biāo)記輔助選育過程提供了新的的依據(jù)和參考。

繁殖性狀是個數(shù)量性狀，受微效多基因調(diào)控，同時也受到胎次、管理、營養(yǎng)水平和飼養(yǎng)環(huán)境的影響。山豬遺傳資源較為稀少，今后還應(yīng)該通過擴(kuò)大樣本的數(shù)量做深入的研究，為遺傳效應(yīng)評價提供更有說服力的依據(jù)。因此，目前同時考慮幾個繁殖性狀基因的協(xié)同作用進(jìn)行分子育種也許更為可取。

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