任向榮， 李 偉， 孫海燕， 陳懷谷， 于漢壽

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014)

由禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis Van der Hoeven)引起的小麥紋枯病已成為中國小麥主產(chǎn)區(qū)小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要威脅［1－2］。該菌通常以菌絲和菌核的形態(tài)習(xí)居于土壤中，自然條件下只發(fā)現(xiàn)無性世代［3－5］。國內(nèi)外學(xué)者對禾谷絲核菌的田間快速檢測、化學(xué)防治及生物防治等方面做了大量研究［6－10］。但對該病原菌的流行學(xué)、基因之間的交流和致病機(jī)理等方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他一些病原菌，其主要原因是到目前為止尚未建立禾谷絲核菌有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而制備高質(zhì)量的與原始菌株遺傳背景一致的原生質(zhì)體是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的前提。

原生質(zhì)體是通過機(jī)械破碎或酶消解細(xì)胞壁而得到的裸露細(xì)胞，質(zhì)膜為細(xì)胞質(zhì)和外界環(huán)境間的唯一屏障，對外界環(huán)境的變化非常敏感。因此，原生質(zhì)體常被用于生化分析［11］、細(xì)胞壁再生過程觀察［12］、發(fā)育學(xué)的研究［13］、標(biāo)記蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位［14］、蛋白質(zhì)間關(guān)系的分析［15－16］以及染色體的改造［17］等。另外，原生質(zhì)體是絲狀真菌細(xì)胞融合、誘變育種和遺傳轉(zhuǎn)化等的理想材料。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在植物病理學(xué)研究中的不斷應(yīng)用和發(fā)展，真菌的遺傳轉(zhuǎn)化越來越受到重視。目前，已有100多種真菌實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化［18］。絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法有多種，包括PEG－原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)等。

有研究結(jié)果表明多核的立枯絲核菌(R.solani)原生質(zhì)體再生菌株無論從形態(tài)、生長速率還是分子水平上都與原始菌株有較大差異［19］，這一現(xiàn)象對進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化等是不利的。禾谷絲核菌細(xì)胞為雙核，其原生質(zhì)體的制備方法，再生菌株與原始菌株之間是否存在差異，以及遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建等研究目前尚未見報(bào)導(dǎo)。本研究采用多種酶消解菌絲細(xì)胞壁的方法探索禾谷絲核菌原生質(zhì)體的制備方法，比較原生質(zhì)體再生菌株和原始菌株在形態(tài)、生長速率、致病力及遺傳組成等方面的差異，并利用PEG－原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等方法嘗試構(gòu)建禾谷絲核菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步研究其致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 原生質(zhì)體制備

采用4種方法獲得用于酶解的菌絲:(1)直接從PSA平板上挑取一定量的禾谷絲核菌R0301菌株(該菌株分離自江蘇省南京市，是強(qiáng)致病力菌株，保藏于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所)的氣生菌絲;(2)參照張穎等［20］的方法并有所改進(jìn)，將挑取的氣生菌絲在研缽中研磨后轉(zhuǎn)移到液體TB3(0.3%酵母浸提物，0.3%蛋白胨和20%蔗糖)培養(yǎng)基中，28℃再培養(yǎng)44 h左右，過濾收集菌絲并用無菌水沖洗;(3)參照Liu等［21］的獲取菌絲的方法，在鋪有玻璃紙的PDA平板上28℃培養(yǎng)44 h左右，將玻璃紙連菌碟一起放進(jìn)無菌水中從而分離獲得菌絲;(4)PDA平板上培養(yǎng)3～5 d后，在菌落邊緣打菌碟，轉(zhuǎn)移到鋪有玻璃紙的PDA平板上28℃再培養(yǎng)44 h左右，用金屬小勺柄或接種針刮取菌絲，該方法是對第3種方法的改良。

將收集得到的菌絲等量轉(zhuǎn)入含2%消化酶(分別是纖維素酶、裂解酶、崩潰酶及溶壁酶)的10 ml 0.7 mol/L滲透壓穩(wěn)定劑(山梨醇、蔗糖、NaCl和MgSO4)中，在30℃、120 r/min條件下酶解。每間隔0.5 h進(jìn)行顯微鏡檢測。酶解0.5～3.0 h后，3層過濾膜過濾收集原生質(zhì)體。

1.2 原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)、核染色及再生

用STC(15%山梨醇，0.7%CaCl2·H2O和5%Tris/HCl，pH 8.0)溶解原生質(zhì)體沉淀，進(jìn)行一定的稀釋后計(jì)數(shù);用10 μg/ml核熒光染料Hoechst 33258(碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)對菌絲和原生質(zhì)體處理5 min后，熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE E400)下觀察核染色情況;將一定量的原生質(zhì)體加入已冷卻至室溫的RM(1.6 mol/L蔗糖，0.4%干酪素水解物，0.4%酵母浸提物和0.85%的瓊脂粉)固體培養(yǎng)基中，輕輕混勻后倒平板;28℃培養(yǎng)6～7 d后，挑取再生培養(yǎng)基上的單菌落，轉(zhuǎn)接到PDA平板上28℃培養(yǎng)，觀察它們與原始菌株在形態(tài)和生長速率等方面的差異。

1.3 原生質(zhì)體再生菌株致病力測定

試驗(yàn)選小麥品種揚(yáng)麥158，將種子播種于裝有滅菌土、口徑為8 cm的塑料盆缽中，每缽播25粒，并蓋上滅菌土。在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)20℃培養(yǎng)，待小麥長到二葉期在莖基部接入直徑為0.5 cm的菌碟，每個菌株3個重復(fù)，接種14 d后參照 Lipps等［22］的分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情。計(jì)算病情指數(shù)，使用DPSv7.05軟件對病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 菌株DNA的提取及AFLP差異分析

從200個再生菌株中隨機(jī)選取100株進(jìn)行差異分析。菌株DNA的提取采用快速基因組DNA試劑盒(東盛生物公司產(chǎn)品)。AFLP試驗(yàn)方法參照Ceresini等［23］和 Vos 等［24］的方法，預(yù)擴(kuò)增引物為EcoRI+G(5'－GACTGCGTACCAATTCG－3')和 MseI+G(5'－GATGAGTCCTGAGTAAG－3')，選擇性擴(kuò)增引物為 EcoRI+GT(5'－GACTGCGTACCAATTCGT－3')和 MseI+GT(5'－GATGAGTCCTGAGTAAGT－3')。AFLP選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物變性后在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，硝酸銀染色顯影。

1.5 遺傳轉(zhuǎn)化

1.5.1 測定禾谷絲核菌對潮霉素B的敏感濃度設(shè)置潮霉素 B 濃度梯度為:0 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml，測定禾谷絲核菌對潮霉素B的敏感濃度。

1.5.2 PEG－原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 按照方法1.1獲得的原生質(zhì)體沉淀，1 ml STC溶解，轉(zhuǎn)入2 ml離心管中;5 000 r/min離心5 min，棄上清;STC懸浮原生質(zhì)體;轉(zhuǎn)化液:90 μl STC+10 μl質(zhì)粒 +100 μl原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到104個、105個和106個，輕輕混勻，室溫靜置20 min;加1 ml SPTC(STC+50%PEG)輕輕混勻，室溫靜置20 min;加5 ml TB3混勻，18℃，121 r/min搖培過夜;第2 d倒制平板，先加入一定體積的潮霉素B到RM培養(yǎng)基中，再倒入過夜的轉(zhuǎn)化液，混勻后倒平板;倒置，28℃培養(yǎng)。

1.5.3 土壤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)AGL－1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑取土壤農(nóng)桿菌AGL－1的單菌落，接種到5 ml液體LB培養(yǎng)基中(含50 μg/ml的卡那霉素)，200 r/min，28 ℃ 下過夜培養(yǎng);將 200 μl上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到5 ml含50 μg/ml卡那霉素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)中，OD600值約為0.15，加入乙酞丁香酮(AS)，濃度為 200 μg/ml，28 ℃ 培養(yǎng)5～6 h使OD600達(dá)到0.5～0.6;用TB3懸浮原生質(zhì)體沉淀;取100 μl經(jīng)處理的農(nóng)桿菌菌液和100 μl原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到104個、105個和106個，混勻后輕輕涂布在含200 μg/ml乙酞丁香酮(AS)的IM固體平板上的玻璃紙上，22℃黑暗培養(yǎng)48 h;把玻璃紙倒置轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上(PSA+50 μg/ml潮霉素 B+400 μg/ml頭孢氨芐 +60 μg/ml鏈霉素)，28℃黑暗培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲獲得方法及細(xì)胞壁消解酶和滲透壓穩(wěn)定劑處理對原生質(zhì)體制備的影響

在以溶壁酶為消解酶和以0.7 mol/L NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑的酶解體系中，4種不同方法獲得的菌絲用于制備原生質(zhì)體，得到的原生質(zhì)體量有很大差異。方法(1)得到的原生質(zhì)體數(shù)為1 ml 101～102個;方法(2)得到的原生質(zhì)體數(shù)為1 ml 0.5×102～1.5×102個;方法(3)制備的原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到1 ml 5×103～104個;方法(4)得到的幼嫩菌絲制備原生質(zhì)體時(shí)，原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到1 ml 106個。而其他消解酶和滲透壓穩(wěn)定劑組合的體系中，沒有觀察到原生質(zhì)體出現(xiàn)。

采用方法(4)得到的幼嫩菌絲，用0.7 mol/L NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑，濃度為2.0%的4種消化酶處理，每間隔0.5 h檢測。直到酶解3 h時(shí)，在含崩潰酶、纖維素酶和裂解酶3種酶的酶解體系中都沒有原生質(zhì)體出現(xiàn);而在溶壁酶的酶解體系中，0.5 h就發(fā)現(xiàn)大量的原生質(zhì)體(圖1)。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，崩潰酶、纖維素酶和裂解酶3種酶對禾谷絲核菌的細(xì)胞壁幾乎沒有消解能力而不能釋放原生質(zhì)體，溶壁酶對禾谷絲核菌的細(xì)胞壁的降解起著非常重要的作用。

圖1 4種滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體釋放的影響Fig.1 Four kinds of osmotic pressure stabilizers influencing protoplast liberation

同種酶的作用下，不同的滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體的釋放有很大影響。崩潰酶、纖維素酶和裂解酶3種酶分別在山梨醇、蔗糖、NaCl和MgSO4中酶解直到3 h都沒有原生質(zhì)體出現(xiàn)。在以溶壁酶為細(xì)胞壁消解酶的作用體系中，直到酶解3 h，以山梨醇為滲透壓穩(wěn)定劑的體系中原生質(zhì)體的釋放量幾乎都為零;而以蔗糖、NaCl和MgSO4為滲透壓穩(wěn)定劑的體系中，酶解0.5 h 1 ml原生質(zhì)體數(shù)已達(dá)到105。以蔗糖滲透壓穩(wěn)定劑的體系中原生質(zhì)體釋放量低于以NaCl和MgSO4為滲透壓穩(wěn)定劑的體系(圖1)。無機(jī)鹽滲透壓穩(wěn)定劑NaCl和MgSO4比有機(jī)物滲透壓穩(wěn)定劑更有利于禾谷絲核菌原生質(zhì)體的釋放，NaCl尤其明顯。酶處理1.5 h時(shí)，在NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑的體系中，1 ml原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到106，但隨著時(shí)間的延長原生質(zhì)體數(shù)并沒有增加反而越來越少(圖1)。長時(shí)間的酶處理可能對原生質(zhì)體有一定的破壞作用。因此，禾谷絲核菌菌絲酶解處理1.5 h左右是收集原生質(zhì)體的相對最佳時(shí)間。

2.2 原生質(zhì)體核染色、萌發(fā)及再生

所制備的原生質(zhì)體純化濃縮后鏡檢呈規(guī)則的球形，大小不一，并有聚集現(xiàn)象(圖2a)。原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)基中的萌發(fā)類似孢子，先長出牙管，慢慢伸長，長到一定長度開始分叉并小于90°(圖2b～d)。在再生培養(yǎng)基(RM)上培養(yǎng)7 d后長出單一分散的白色菌落(圖2e)。對菌絲及原生質(zhì)體細(xì)胞核進(jìn)行染色和鏡檢，觀察到菌絲及原生質(zhì)體的細(xì)胞核數(shù)目一致，均為雙核(圖3)。把再生培養(yǎng)基上(圖2e)的單一菌落轉(zhuǎn)接到普通PDA培養(yǎng)基上生長，隨機(jī)挑取部分原生質(zhì)體再生菌株，共200株，再生菌株在形態(tài)上與原始菌株沒有差異。

圖2 禾谷絲核菌的原生質(zhì)體萌發(fā)及再生Fig.2 The protoplast germination and regeneration of R.cerealis

圖3 菌絲及原生質(zhì)體的細(xì)胞核Hoechst 33258染色Fig.3 Nuclear staining of hypha and protoplasts with Hoechst 33258

2.3 再生菌株的生長速率及致病力分析

從100個再生菌株(用于后面的AFLP試驗(yàn))中隨機(jī)挑選15株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定其生長速率，結(jié)果表明原生質(zhì)體再生菌株與原始菌株的生長速率無顯著差異(圖4a)。對原始菌株R0301和15個再生菌株進(jìn)行了致病力測定，病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果表明，15個禾谷絲核菌再生菌株的致病力沒有明顯差異，與原始菌株的差異也不顯著(圖4b)。

圖4 禾谷絲核菌原始菌株和原生質(zhì)體再生菌株生長速率(a)及致病力(b)比較Fig.4 The growth rate(a)and pathogenicity(b)of regenerated and original strains of R.cerealis

2.4 原生質(zhì)體再生菌株的AFLP差異分析

隨機(jī)選擇了100個再生菌株，提取其基因組DNA。通過AFLP分子標(biāo)記差異分析共得到20個片段，分布在50 bp～2 000 bp之間。電泳結(jié)果表明再生菌株之間不存在多樣性，再生菌株與原始菌株之間也沒有差異(圖5)。

圖5 原生質(zhì)體再生菌株的AFLP分子標(biāo)記Fig.5 The analysis of protoplast regenerated strains by AFLP

2.5 遺傳轉(zhuǎn)化體系

潮霉素B濃度為50 μg/ml時(shí)，對禾谷絲核菌的抑制率已經(jīng)達(dá)到了100%(表1)。因此，選擇轉(zhuǎn)化子的潮霉素B濃度為50 μg/ml。原生質(zhì)體數(shù)量為104個、105個和106個時(shí)，分別采用 PEG－原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，多次嘗試沒有獲得轉(zhuǎn)化子。針對禾谷絲核菌的遺傳轉(zhuǎn)化，通過多次探究沒有成功建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系。

表1 禾谷絲核菌R0301對潮霉素B的敏感性Table 1 The susceptibility of R.cerealis R0301 to hygromycin B

3 討論

原生質(zhì)體是遺傳轉(zhuǎn)化、融合、誘變育種、觀察細(xì)胞壁構(gòu)成及了解內(nèi)生病毒傳播情況等的理想材料，有助于探索絲狀真菌的生化特性及遺傳學(xué)及生理學(xué)研究等［19］。原生質(zhì)體的制備與很多因素有關(guān)，如酶的種類、滲透壓穩(wěn)定劑、酶作用時(shí)間及溫度和菌齡等。

一般處于對數(shù)生長期的真菌幼嫩菌絲用于酶解制備原生質(zhì)體效果最好［25］。幼嫩菌絲的獲得對原生質(zhì)體的制備也非常關(guān)鍵。禾谷絲核菌在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生孢子［3］，所以不能像大多數(shù)產(chǎn)孢真菌那樣通過孢子萌發(fā)獲得幼嫩菌絲。培養(yǎng)長時(shí)間之后的氣生菌絲質(zhì)地過密且已老化，去壁較難不適于原生質(zhì)體的制備。采用從鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上獲得的幼嫩菌絲用于酶解，可得到大量的原生質(zhì)體，并且方法簡單易行，耗時(shí)短。

原生質(zhì)體的制備很大程度上依賴細(xì)胞壁消解酶的選擇，而細(xì)胞壁消解酶的選擇又和該菌的細(xì)胞壁組成相關(guān)。禾谷絲核菌是一種擔(dān)子菌，它的細(xì)胞壁主要成分是葡聚糖、幾丁質(zhì)等［26］。纖維素不是禾谷絲核菌的細(xì)胞壁主要成分，單一的纖維素酶對禾谷絲核菌幾乎沒有消化作用。崩潰酶(Driselase)和裂解酶(Lysing enzymes)是立枯絲核菌的高效細(xì)胞壁消解酶［21］，在本試驗(yàn)中，它們對禾谷絲核菌的細(xì)胞壁幾乎都沒有消解作用。禾谷絲核菌同立枯絲核菌在胞壁組成上可能存在一定的差異。

滲透壓穩(wěn)定劑可維持原生質(zhì)體細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓平衡，也影響酶的活性［27］。不同的細(xì)胞壁消化酶在作用同一底物時(shí)，也會有它們適宜的滲透壓穩(wěn)定劑。崩潰酶、纖維素酶和裂解酶3種酶分別在山梨醇、蔗糖、NaCl和MgSO44種滲透壓穩(wěn)定劑中都沒有原生質(zhì)體出現(xiàn)，溶壁酶在本試驗(yàn)所用的滲透壓穩(wěn)定劑(除山梨醇外)中都有大量原生質(zhì)體產(chǎn)生。無機(jī)鹽滲透壓穩(wěn)定劑特別是NaCl更有利于禾谷絲核菌原生質(zhì)體的產(chǎn)生。

顯微鏡下的原生質(zhì)體呈規(guī)則的球形，并存在聚集現(xiàn)象。有研究結(jié)果表明原生質(zhì)體通過細(xì)胞壁的殘余物質(zhì)粘連，這一現(xiàn)象有助于原生質(zhì)體的細(xì)胞壁復(fù)原及再生。Liu等［28］制備立枯絲核菌的原生質(zhì)體，恢復(fù)原生質(zhì)體細(xì)胞壁可制成人工孢子。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，禾谷絲核菌也不產(chǎn)生任何有性或無性孢子，利用立枯絲核菌制造人工孢子的原理，可能得到禾谷絲核菌的人工孢子，用于篩選禾谷絲核菌的殺菌劑和抗病小麥品種等。另外，根據(jù)產(chǎn)孢菌單孢分離的方法，進(jìn)行單原生質(zhì)體分離［29］，可以對不產(chǎn)孢的禾谷絲核菌進(jìn)行菌株純化等應(yīng)用。

制備得到的原生質(zhì)體與原始菌株的遺傳背景一致是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、誘變育種等的前提。Thomas等［19］的研究結(jié)果表明立枯絲核菌的原生質(zhì)體不僅細(xì)胞核數(shù)目不同，而且生長速率和形態(tài)都有很大差異。本研究通過細(xì)胞核染色發(fā)現(xiàn)，制備的禾谷絲核菌原生質(zhì)體都以雙核的形式存在，與原始菌株菌絲細(xì)胞內(nèi)的核數(shù)目一致。再生菌株的形態(tài)、生長速率等與原始菌株也沒有差異。AFLP分子標(biāo)記檢測的結(jié)果表明，禾谷絲核菌原生質(zhì)體再生菌株之間遺傳組成可能沒有差異，并且與原始菌株之間也可能無差異。致病力測定結(jié)果也顯示原生質(zhì)體再生菌株與原始菌株之間無顯著性差異。以上結(jié)果表明，禾谷絲核菌再生菌株和原始菌株之間幾乎不存在差異，我們的制備體系沒有改變原始菌株的遺傳背景。本研究建立的體系可制備大量的與原始菌株遺傳背景一致的原生質(zhì)體，可用于轉(zhuǎn)化及誘變等一系列遺傳操作。

本試驗(yàn)通過多次嘗試PEG－原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，沒有成功建立禾谷絲核菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。可能原因是，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，禾谷絲核菌不產(chǎn)生任何有性或無性孢子，并且細(xì)胞內(nèi)存在雙核等［3］。這些現(xiàn)象對禾谷絲核菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立都是非常不利的。另一方面，已經(jīng)嘗試的轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)化條件可能不適合禾谷絲核菌的轉(zhuǎn)化。關(guān)于絲核菌屬的遺傳轉(zhuǎn)化體系，國內(nèi)外很少有成功的報(bào)道，主要原因是很難發(fā)現(xiàn)絲核菌的有性態(tài)生活階段，無性態(tài)又不產(chǎn)生任何孢子，同時(shí)絲核菌屬的細(xì)胞內(nèi)存在多核現(xiàn)象等［3］。對于絲核菌屬的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立有待于人們繼續(xù)研究。

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