劉江紅，徐瑞丹，潘 洋，蘆 艷

（1 東北石油大學化學化工學院石油與天然氣化工省高校重點實驗室，黑龍江 大慶 163318；2 廈門大學生命科學學院，福建 廈門 361005；3 同聯(lián)集團沈陽抗生素廠，遼寧 沈陽 11012）

部分水解聚丙烯酰胺（partially hydrolyzed polyacrylamide，HPAM）以其良好的絮凝性被廣泛用來提高原油的采收率[1]，聚丙烯酰胺注入地下后，少部分隨原油被采出，而大部分存在于油層中，隨原油吸附在土壤及巖石表面，導致油井周圍的土壤中含有大量的聚丙烯酰胺和原油，給環(huán)境帶來危害[2]。微生物降解以其特有的無害化處理將成為解決聚丙烯酰胺引起環(huán)境污染潛在毒性的有效手段[3]。然而，游離微生物在處理含聚污水的過程中菌體易流失，且污水中的一些有害物質會對微生物產生毒害作用[4]。而微生物固定化技術可以減輕或消除菌體的流失，并且使微生物保持活性，可反復使用，固定化后微生物對有毒物質的承受能力及對有機物的降解能力都有明顯的提 高[5]。因此微生物固定化技術成為生物及環(huán)境領域的研究熱點[6]。目前，微生物固定化的制備方法可分為吸附法、共價法、包埋法和交聯(lián)法4 種[7]。

作者采用微生物固定化方法處理聚丙烯酰胺污染和石油污染的土壤，從污染土壤中篩選出聚丙烯酰胺和原油高效降解菌，篩選出的菌株既可以以聚丙烯酰胺作為唯一氮源又可作為唯一作為碳源被利用，解決了之前研究中聚丙烯酰胺只能作為微生物繁殖的氮源不能作為碳源的缺陷。并且選擇包埋固定化方法處理聚丙烯酰胺污染土壤。

1 實驗材料

1.1 土壤樣品

實驗用土壤采自大慶油田采油四廠的一口聚丙烯酰胺與原油污染的井場，在離地表約5～20cm 處取樣，將取得的樣品裝入已經滅菌的樣品袋中，密封。過40 目篩，樣品放置于冰箱中4℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

（1）無機鹽培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 1.0，NH4NO31.0，KH2PO41.0，CaCl20.02，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eCl3痕量。

（2）分離、純化培養(yǎng)基(g/L)：向上述（1）的培養(yǎng)基中加入HPAM 0.5，瓊脂1.5%～2.0%，調節(jié)pH 值至7.2。

（3）活化培養(yǎng)基(g/L)：HPAM 0.5，NaCl 0.5，蛋白胨6.0，尿素9.0，KH2PO40.5，MgSO40.5。

（4）基礎培養(yǎng)基(g/L)：向上述（1）的培養(yǎng)基中加入HPAM 0.5，調節(jié)pH=7.0。

（5）菌種保藏斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細菌）和馬丁氏培養(yǎng)基（真菌）。

2 實驗方法

2.1 菌種篩選與鑒定

（1）菌種篩選 將10 g 聚丙烯酰胺污染的土壤樣品加入到含聚丙烯酰胺100 mg/L，葡萄糖500 mg/L 的上述1.2 節(jié)（1）的無機鹽培養(yǎng)基中，HZQX100 立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱，120 r/min，35 ℃下培養(yǎng)，待培養(yǎng)液變渾濁，吸取5 mL 培養(yǎng)液，將移取的液體加到含聚丙烯酰胺300 mg/L，葡萄糖 300 mg/L 的培養(yǎng)基中放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，重復上述過程直到細菌在含聚丙烯酰胺 500 mg/L，葡萄糖濃度為0 mg/L 的培養(yǎng)基中能生長為止。制作上述1.2 節(jié)（2）的分離、純化培養(yǎng)基，接種環(huán)挑取微生物培養(yǎng)液在培養(yǎng)基上劃線，劃線之后將培養(yǎng)基放入溫度為35 ℃，轉速為120 r/min 的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌落后，通過電鏡觀察菌株是否純化。

（2）菌種鑒定 微生物菌株的形態(tài)觀察與生理生化反應參照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[8]與伯杰氏細菌鑒定手冊。將菌株初步鑒定到屬。

2.2 測定方法

（1）聚丙烯酰胺降解率的測定：采用淀粉-碘化鎘比色法測定聚丙烯酰胺的濃度。

（2）土壤原油含量的測定：分光光度法[9]。

2.3 菌體生物量的測定

采用722 型可見分光光度計測定溶液的OD660值（光密度）來表示生物生長量的多少，OD 值是物質在溶液中吸收特定波長光線強弱的參數(shù)。在波長為660 nm 處對含聚丙烯酰胺的微生物培養(yǎng)液進行光密度的測量，光密度值與菌群菌數(shù)成正比。將單菌以3%的體積比接入1.2 節(jié)（4）的基礎培養(yǎng)基中，在35 ℃、120 r/min 條件下放入振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以蒸餾水作為空白對照進行測定，以此作為微生物菌群生長曲線的參考指標。

2.4 單一菌種與混合菌降解聚丙烯酰胺和原油的效果比較

將活化后的單一菌種與4 種單菌R1，R2，R3，Y3 的混合菌按照3%的總體積分數(shù)分別加入上述1.2 節(jié)（4）的基礎培養(yǎng)基中，于35 ℃、120 r/min條件下放入振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 天后測HPAM 與原油的去除率，比較單一菌種與混合菌種對HPAM和原油的降解效果。

2.5 微生物固定化顆粒的制備

（1）制備濕菌體 將篩選出四種單菌的混合菌作為固定化的菌體，將菌株依次接入200 mL 的1.2節(jié)（3）所示的活化培養(yǎng)基中，經過4 次連續(xù)活化。取活化后的培養(yǎng)液2 mL 加入到200 mL 的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 天，富集培養(yǎng)基經離心機離心，得到濕菌體。

（2）包埋法固定化顆粒的制備 4 種固定化方法中包埋固定化法以其操作簡單，對微生物活性影響小，制作的固定化微生物小球的強度高等優(yōu)點優(yōu)于其它3 種固定化方法，所以本實驗采用包埋法。以蒸餾水配置一定濃度的包埋載體溶液，加入一定量的濕菌體，用5 mL 注射器吸取載體溶液，將載體溶液滴入一定濃度的交聯(lián)劑中，交聯(lián)一定時間，將固定化顆粒放入200 mL 的1.2 節(jié)（4）所示的基礎培養(yǎng)基中，35 ℃，120 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)降解聚丙烯酰胺。

（3）5 種包埋固定化制備方法 采用5 種包埋法進行微生物的固定化，5 種包埋固定化法制備微生物固定化顆粒的條件如表1 所示。

按照表1 中的制備條件制備固定化顆粒，比較5 種包埋法制備微生物固定化顆粒的難易程度、小球強度和韌性以及制備費用，從中選擇一種制備費用低廉、制備容易、強度和韌性都較好的包埋方法。

2.6 微生物固定化顆粒降解HPAM 和原油的效果

以固定化顆粒對聚丙烯酰胺的降解率與對原油的去除率來比較幾種包埋固定化方法。按照表1 中的5 種包埋固定化制備方法，制作固定化顆粒，各稱取10 mL 載體與濕菌體的混合物制得的固定化顆粒，分別放入200 mL 的1.2 節(jié)（4）所示的基礎培養(yǎng)基中，在35 ℃，120 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，測聚丙烯酰胺的降解率。

2.7 微生物固定化處理采油污水污染土壤

取大慶油田采油四廠的一口井場取回的聚丙烯酰胺與原油污染土壤，先除去其中的磚塊、瓦礫等雜物后自然風干，再將土樣過40 目篩，得到顆粒大小均勻的土樣，將土壤樣品加入到1.2 節(jié)（1）所示的200 mL 基礎培養(yǎng)基中，測得培養(yǎng)基中聚丙烯酰胺濃度為500 mg/L，原油濃度為733.21 mg/L。取10 mL PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的載體與濕菌體的混合物制得的固定化顆粒放入上述培養(yǎng)基中，在35 ℃，120 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天測聚丙烯酰胺的降解率，并采用分光光度法測原油含量。

3 結果與討論

3.1 菌種篩選結果

經分離純化得到4 株對聚丙烯酰胺有降解效果的菌種，即R1、R2、R3、Y3。菌落圖片和菌株電鏡掃描圖片如圖1 所示。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，可以初步鑒定：R1 為芽孢乳桿菌屬，R2 為微球菌屬，R3、Y3 為假單胞菌屬菌株。

3.2 標準曲線繪制

以HPAM 標準溶液濃度為橫坐標，可見分光光度計測得的OD420值為縱坐標繪制的HPAM 濃 度-吸光度標準曲線。曲線的線性回歸方程為y=0.0386x+0.0019，R2=0.9995。測定待測溶液吸光度值，即可從線性回歸方程計算出待測溶液的實際HPAM 濃度。

3.3 單菌生物量的測定

以OD660值代表細菌的生物量，菌體生長量越多，培養(yǎng)基越渾濁，OD660值越大。因此，OD660值越大。表示菌體生物量越多。微生物生長曲線如圖2 所示。

如圖2 所示，微生物的生長曲線反映一種微生物在一定生活環(huán)境中的生長繁殖和死亡規(guī)律。由圖2 的生長曲線可以看出，4 種菌體在含500 mg/L 聚丙烯酰胺的培養(yǎng)基中生長繁殖，菌體經歷了停滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。

表1 5 種包埋法制備微生物固定化顆粒的條件

圖1 菌落照片和菌株電鏡掃描照片(×10K)

圖2 單菌在含聚丙烯酰胺的培養(yǎng)基中生長曲線圖

3.4 混合菌的優(yōu)勢

由圖3、圖4 可知，R1、R2、R3、Y3 四種單菌組成的混合菌對HPAM 和原油的去除率都明顯高于4 種單菌，混合菌對HPAM 的降解率在第3 天基本保持穩(wěn)定，達到55%以上，對原油的去除率可達到75%以上。這可能是由于單一菌種不具備一整套完整的酶系統(tǒng)或基因成分降解這些不易降解的有機物，而微生物群落中不同基因的擁有者卻可能發(fā)生基因交換或重組，從而導致新的降解途徑的實現(xiàn)。

3.5 微生物固定化

（1）5 種包埋方法比較 對5 種包埋法的制備難易程度、固定化后小球的強度和韌性及制作成本進行對比，結果如表2 所示，海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯(lián)結合法與明膠-戊二醛法這兩種方法制作費用高，且明膠-戊二醛法操作較困難，制成的固定化顆粒形狀不規(guī)則，海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯(lián)結合法制備的小球韌性、強度一般。因此排除海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯(lián)結合法與明膠一戊二醛法這兩種方法，選用其余3 種制備費用低廉的方法測定固定化微生物顆粒降解HPAM 和原油的 效果。

5 種包埋法制備固定化顆粒的難易程度、小球強度和韌性以及制備費用比較如表2 所示。

圖3 混合菌與單菌對聚丙烯酰胺降解率的比較

圖4 混合菌與單菌對原油去除率的比較

表2 5 種包埋固定化方法的比較

表3 固定化顆粒降解HPAM 和原油的效果

（2）微生物固定化顆粒降解HPAM 和原油的效果 通過由表2 篩選出的3 種包埋固定化方法制得的固定化顆粒對聚丙烯酰胺的降解率的測定，結果如表3 所示，海藻酸鈉+活性炭粉法與PVA 冷凍法對聚丙烯酰胺降解率與對原油的去除率低于PVA+海藻酸鈉+添加劑法。因此，排除海藻酸鈉+活性炭粉法與PVA 冷凍法兩種方法。

綜合表2 與表3，得知PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化顆粒的活性較好，操作簡單，強度好，不易破損，且費用低，PVA+海藻酸鈉+添加劑法對聚丙烯酰胺的降解率高于其它兩種包埋方法。因此選用PVA+海藻酸鈉+添加劑法對含聚丙烯酰胺的土壤進行處理。張秀霞等[10]以天然有機材料YJ-05 為載體，采用吸附法制備固定化MM-7 對土壤中石油的降解率可達到27.1%。

由之前的實驗3.4 節(jié)混合菌的優(yōu)勢可知，游離的混合菌對HPAM 降解率達到55%以上，對原油的去除率可達到75%以上，而由表3 得知在相同實驗條件下PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化顆粒對聚丙烯酰胺的降解率可達到78.2%，對原油的去處率可達到98.3%。可見固定化后的菌株對聚丙烯酰胺與原油的處理能力要遠遠強于沒有固定化的游離菌株。

圖5 固定化顆粒

PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化顆粒如圖5 所示。圖5(a)為10%PVA-1%海藻酸鈉與濕菌體按1 ∶2 體積比混合后，加入3%S i O2，0.3%CaCO3。用5 mL 注射器注射到2%的CaCl2飽和硼酸溶液中成球，CaCl2與飽和硼酸共同交聯(lián)24 h后的固定化顆粒，顆粒并無拖尾現(xiàn)象。圖5(b)為在相同制備方法時加入3%的活性炭制得的固定化顆粒，以增加固定化顆粒的通透性，提高微生物的活性。

3.6 微生物固定化處理采油污水污染土壤

PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的微生物固定化顆粒處理采油污水污染的土壤，處理后的土壤樣品放入電熱鼓風干燥箱中干燥后送回井場，固定化顆粒降解土壤中HPAM 和原油的效果實驗結果如表4所示。由表4 可以看出，PVA+海藻酸鈉+添加劑法制備的固定化顆粒對采油污水污染土壤進行處理，固定化顆粒對HPAM、原油的去除率分別為79.5%和98.7%。

表4 固定化顆粒降解土壤中HPAM 和原油的效果

4 結 論

（1）實驗以篩選出以聚丙烯酰胺作為唯一碳源和唯一氮源的菌株為目的，從含HPAM 的土壤中分離、純化得到對HPAM 具有高效降解能力的R1、R2、R3、Y3 四種單菌。對篩選出的單菌進行鑒定可知：R1 為芽孢乳桿菌屬，R2 為微球菌屬，R3、Y3 為假單胞菌屬菌株。

（2）將R1、R2、R3、Y3 混合，在35℃，120 r/min 條件下，混合菌對HPAM 的降解率可達到55%以上，對原油的去除率達到75%以上。明顯高于4種單一菌種對HPAM 和原油的去除率。

（3）為提高混合菌對聚丙烯酰胺與原油的去除率，采用固定化法對混合菌進行固定化實驗。比較5 種包埋固定化法得知，PVA+海藻酸鈉+添加劑法對聚丙烯酰胺與原油的去除率高于其它4 種包埋固定化方法。PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化顆粒的活性較好，操作簡單，強度好，不易破損，且費用低。

（4）游離的混合菌對HPAM 與原油的去除率可達到75%與55%以上，而PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化顆粒對聚丙烯酰胺與原油的去處率可達到78.2%與98.3%?？梢姽潭ɑ蟮木陮郾０放c原油的處理能力要遠遠強于沒有固定化的游離菌株。

（5）PVA+海藻酸鈉+添加劑法制備的固定化顆粒對采油污水污染土壤進行處理，聚丙烯酰胺的去除率可達到79.5%，原油的去除率可達到98.7%。

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