董偉清，閉志強(qiáng)，唐軍，江文，高美萍，周維，陳麗娟，蔡炳華

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，南寧，530007）

多效唑?qū)τ蠓N質(zhì)離體保存影響的初步研究

董偉清，閉志強(qiáng)，唐軍，江文，高美萍，周維，陳麗娟，蔡炳華

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，南寧，530007）

以荔浦芋無(wú)菌試管苗為材料，研究了試管苗保存過(guò)程中不同濃度多效唑（PP333）對(duì)試管苗保存效果的影響。研究結(jié)果表明，多效唑?qū)τ蠓N質(zhì)資源的離體保存有顯著影響，在光照時(shí)間14～16 h/d，光照強(qiáng)度1 500 lx，室溫（26± 2）℃的培養(yǎng)條件下，在MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L＋30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中添加0.6 mg/L PP333，試管苗可保存240 d，存活率為89.7%，且恢復(fù)生長(zhǎng)后試管苗形態(tài)正常、長(zhǎng)勢(shì)良好，與對(duì)照株無(wú)明顯差異。

芋；離體保存；生長(zhǎng)恢復(fù)；多效唑

芋（Colocasia esculentaL.Schott），又名芋艿、芋頭，其球莖富含淀粉、維生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，是世界各地廣為栽培的蔬菜和糧食作物[1]，也是可選的生物能源作物。廣西是我國(guó)芋主產(chǎn)區(qū)之一，擁有眾多馳名中外的優(yōu)良品種，如廣西荔浦縣的荔浦芋和梧州紅芽芋是主要的出口芋產(chǎn)品。由于芋為無(wú)性繁殖作物，長(zhǎng)期反復(fù)種植造成許多優(yōu)良品種種性退化、品質(zhì)變劣,種植面積日益減少，甚至瀕臨絕種；一些野生芋種質(zhì)資源也因環(huán)境的改變和人為因素的破壞而逐漸消失。因此，作為廣西特色農(nóng)作物，芋的種質(zhì)資源保存利用研究已迫在眉睫。對(duì)無(wú)性繁殖的蔬菜種質(zhì)資源而言，因?yàn)椴荒芤苑N子形式進(jìn)行低溫保存，所以離體保存技術(shù)是理想的保存途徑之一[2]。本文通過(guò)在基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的多效唑（PP333），研究其對(duì)芋離體保存的影響，并對(duì)長(zhǎng)期保存的材料進(jìn)行生長(zhǎng)恢復(fù)，為芋種質(zhì)資源中長(zhǎng)期保存體系的建立提供可選的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 無(wú)菌材料的制備

以優(yōu)良荔浦芋品種桂芋一號(hào)為試材，切取飽滿的頂芽或側(cè)芽，用自來(lái)水沖洗20 min，晾干，70%乙醇表面消毒30 s，浸入0.1%升汞溶液消毒10 min，無(wú)菌水沖洗4次，在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)∏o尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L＋30 g/L蔗糖中。1周后，外植體開(kāi)始膨大，隨后長(zhǎng)出葉片，待芽長(zhǎng)到1.5～2.0 cm時(shí)，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L＋30 g/L蔗糖中擴(kuò)繁。

1.2 離體保存與生長(zhǎng)恢復(fù)

選用生長(zhǎng)勢(shì)一致的試管幼苗，以MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L＋30 g/L蔗糖為基本培養(yǎng)基，分別添加生長(zhǎng)抑制劑多效唑（PP333）0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/L。培養(yǎng)條件：光照時(shí)間14～16 h/d，光照強(qiáng)度1 500 lx，室溫（26±2）℃。每處理隨機(jī)選取10瓶，每瓶3株，定期觀察記載其生長(zhǎng)情況和存活率。材料保存一定時(shí)間后取出，在室溫和光照條件下恢復(fù)生長(zhǎng)30 d后，轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基上，調(diào)查保存材料的生物學(xué)性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 多效唑（PP333）濃度對(duì)芋試管苗存活率的影響

將芋離體保存在添加不同濃度多效唑的MS培養(yǎng)基上，定期檢查其存活率，并與對(duì)照（CK）作比較，從表1可以看出，附加生長(zhǎng)抑制劑PP333，可提高芋試管苗的存活率。短期內(nèi)（60 d）各處理存活率均能達(dá)到100%。保存 120 d后，PP333濃度在 0.4～ 0.8 mg/L范圍時(shí)，芋種質(zhì)存活率提高，為82.0%～ 94.6%，均高于對(duì)照。保存180 d后，PP333各濃度處理都能提高芋種質(zhì)的存活率，濃度在0.6～0.8 mg/L范圍的存活率與保存120 d的效果相當(dāng)，但PP333濃度為1.0～1.2 mg/L時(shí)，存活率明顯下降。保存240 d后，對(duì)照組植株枯萎死亡，僅存少量。PP333濃度為0.4 mg/L時(shí)，在180 d時(shí)的存活率（74.2%）明顯高于PP333濃度為 1.0～1.2 mg/L的存活率 （49.0%～ 52.2%），但240 d后，其存活率迅速下降到23.6%，遠(yuǎn)低于濃度為 1.0～1.2 mg/L的存活率 （42.0%～ 51.4%）。結(jié)果顯示，不同的保存時(shí)間，不同濃度的PP333處理離體芋種質(zhì)的存活率不盡相同，其中MS培養(yǎng)基中含0.6 mg/L PP333的處理，芋離體種質(zhì)的存活率最高，240 d后仍可達(dá)到89.7%。培養(yǎng)基中不添加PP333或濃度過(guò)低、過(guò)高都不利于芽的試管保存。

2.2 不同濃度多效唑（PP333）對(duì)試管苗長(zhǎng)勢(shì)的影響

從試管苗的株高變化來(lái)看（表2），隨著PP333添加濃度的提高，芋離體植株株高逐漸降低，說(shuō)明PP333能有效抑制植株的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。保存30 d時(shí)，PP333抑制株高的效果并不十分明顯，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸加強(qiáng)，180 d后，對(duì)照組生根明顯，無(wú)分蘗，葉片枯萎。其中控制植株高度（5.5 cm）較合適的PP333濃度為0.4 mg/L，但該濃度下試管苗的存活率不如處理2、3的高（表l）。此外，隨PP333濃度的提高，植株變得粗壯，葉色濃綠，PP333濃度為1.2 mg/L時(shí)，葉片增厚，變脆。當(dāng)保存120、180、240 d時(shí)，均是濃度為0.6 mg/L的效果最為理想。

表1 不同濃度多效唑（PP333）對(duì)芋試管苗存活率的影響

表2 不同濃度多效唑（PP333）對(duì)芋試管苗株高的影響

表3 離體保存恢復(fù)后的試管苗性狀

2.3 不同濃度多效唑（PP333）對(duì)保存芋試管苗恢復(fù)培養(yǎng)的影響

將連續(xù)保存240 d存活下來(lái)的芋試管苗轉(zhuǎn)接至繼代及生根培養(yǎng)基上恢復(fù)生長(zhǎng)，每間隔20 d繼代一次，連續(xù)繼代3次，結(jié)果見(jiàn)表3。離體保存的芋試管苗經(jīng)繼代恢復(fù)后，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，平均株高和叢生芽倍數(shù)略低于正常水平，葉片形態(tài)正常，長(zhǎng)度和寬度變化不大，顏色翠綠；生根情況正常，根系發(fā)達(dá)，單株根數(shù)3～4條，15 d后根長(zhǎng)至3～4 cm，白皙粗壯。保存后恢復(fù)的試管苗生物學(xué)性狀與保存前試管苗無(wú)明顯差異，尚未見(jiàn)變異植株與其他不良影響。

3 討論與結(jié)論

建立在組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上的緩慢生長(zhǎng)離體保存是在保證植物種質(zhì)遺傳完整性的前提下減緩試管苗的生長(zhǎng)，減少繼代次數(shù)，達(dá)到中、長(zhǎng)期保存植物種質(zhì)資源的目的[3]。通過(guò)添加生長(zhǎng)延緩劑或生長(zhǎng)抑制劑，可抑制保存材料的生長(zhǎng)，延緩其繼代周期。常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)有脫落酸（ABA）、矮壯素（CCC）、多效唑（PP333）、丁酰肼（B9）、馬來(lái)酰肼（MH）等[4]。 目前，在草莓[5]、蘋(píng)果[6]、菠蘿[7]、柑橘[8]、姜[9]、菊花[10]、紅根草[11]上均有關(guān)于多效唑延長(zhǎng)種質(zhì)保存時(shí)間的研究報(bào)道，而對(duì)芋種質(zhì)離體保存研究十分缺乏，僅宋明等[12]、畢可華[1]對(duì)芋的保存作了研究探討。

本文應(yīng)用多效唑（PP333）作為生長(zhǎng)抑制劑，通過(guò)0.4～1.2 mg/L濃度試驗(yàn)，將芋試管苗保存240 d后恢復(fù)培養(yǎng)，結(jié)果表明，在光照時(shí)間14～16 h/d，光照強(qiáng)度1 500 lx，室溫（26±2）℃的培養(yǎng)條件下，PP333的使用可以減緩材料的生長(zhǎng)速度，有效延緩繼代時(shí)間，顯著提高芋試管苗常溫保存的成活率。綜合芋試管苗存活率、株高、離體保存恢復(fù)后的試管苗性狀各因素，以PP3330.6 mg/L的使用濃度取得的保存效果較佳。在離體保存過(guò)程中，隨PP333濃度的提高，芋試管苗形態(tài)特征發(fā)生變化，如植株變得粗壯，葉色濃綠，PP333濃度為1.2 mg/L時(shí)，葉片增厚，變脆。但進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)后，試管苗恢復(fù)正常，可能是植物對(duì)逆境刺激所產(chǎn)生的適應(yīng)性變化。本試驗(yàn)僅初步探討了PP333對(duì)芋離體保存的影響，下一步需要綜合利用多種因素，如低溫、多種生長(zhǎng)抑制劑共同作用等，研究芋種質(zhì)的離體保存，在保證植物種質(zhì)遺傳完整性的前提下，更大限度地延長(zhǎng)芋試管苗離體保存時(shí)間。

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Effects of Paclobutrazol on Conservation of Taro(Colocasia esculentaL.Schott) Germplasm Resourcesin Vitro

DONG Weiqing,BI Zhiqiang,TANG Jun,JIANG Wen,GAO Meiping, ZHOU Wei,CHEN Lijuan,CAI Binghua
(Biotechnology Research institute,Guangxi Academy of Agriculture Sciences,Nanning 530007)

In this research,we studied the conservation effects of paclobutrazol with different concentrations on taro (Colocasia esculentaL.Schott)seedlingsin vitro.The results showed that,paclobutrazol affected thein vitroconservation of taro germplasm resources significantly,and the best culture medium was MS+2.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA＋30 g/L sucrose+0.6 mg/L PP333,which could conserve plantlets for 240 days with the survival rate of 89.7%,under the cultural condition with illumination time of 14-16 hours per day,illumination intensity of 1 500 lx and room temperature of(26±2)℃. Furthermore,the recovered plantlets grew well and showed no difference in morphology with those of control treatment.

Taro(Colocasia esculentaL.Schott);In vitroconservation;Growth recovery;Paclobutrazol

S632.1；S482.8+.92

A

1001-3547（2013）24-0037-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.24.013

國(guó)家科技支撐計(jì)劃子課題（2012BAD27B01-6），廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)-重點(diǎn)項(xiàng)目（桂農(nóng)科2013YZ02），廣西壯族自治區(qū)南寧市青秀區(qū)科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2013N08）

董偉清（1981－），女，碩士，助理研究員，主要從事植物生物技術(shù)研究工作，電話：18677099255，E-mail：529516161@qq.com

閉志強(qiáng)，通信作者，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事作物遺傳育種研究工作，電話：0771-3244185，E-mail：zhiqiangbi@163.com

2013-11-08