劉曉艷，閔勇，張薇，王開梅，萬中義，江愛兵，張光陽，程賢亮，楊自文

（1.國家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢，430064；2.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院）

微生物全基因組范圍內(nèi)的最小基因組研究進(jìn)展

劉曉艷1，閔勇1，張薇2，王開梅1，萬中義1，江愛兵1，張光陽1，程賢亮1，楊自文1

（1.國家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢，430064；2.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院）

最小基因組是當(dāng)前合成生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，從全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)研究入手，介紹了最小基因組研究的必要性和技術(shù)方法，并對其在工業(yè)微生物分子育種中的應(yīng)用進(jìn)行分析，綜合闡述了最小基因組研究的發(fā)展前景。

微生物；全基因組；最小基因組；分子育種

1 基因組代謝網(wǎng)絡(luò)

如今，伴隨著高通量測序技術(shù)的應(yīng)用和費(fèi)用的降低，全基因組測序技術(shù)也越來越受歡迎。通過基因組測序，對基因進(jìn)行功能注釋，把基因編碼蛋白所催化的生化反應(yīng)稱為一個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)，通過計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化為數(shù)學(xué)模型，再用試驗(yàn)數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證，提出假設(shè)，能夠?qū)ι矬w以及生物現(xiàn)象作出預(yù)測，是合成生物學(xué)研究中的一個(gè)重要的研究手段[1]。

2 研究最小基因組的必要性

最小基因組是指在最合適的條件下維持細(xì)胞生長繁殖所必需的最少基因[2]，優(yōu)勢小基因組菌株是指含有特殊功能基因/簇的最小基因組菌株。通過對菌株基因組的減縮，可以達(dá)到如下目的：①可以提高菌株的代謝效率、降低代謝冗余；②基因組越小，微生物生長速度越快；③增加目標(biāo)產(chǎn)物合成量，消除副產(chǎn)物[3～5]，解決目前發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中存在的發(fā)酵過程有副產(chǎn)物、底物轉(zhuǎn)化率偏低、生長周期過長、增效因子產(chǎn)量較低和菌株不穩(wěn)定等問題。

3 最小基因組研究內(nèi)容和手段

3.1 菌株全基因組測序

截止到2011年7月1日，據(jù)Genomes Online Database數(shù)據(jù)庫報(bào)道：6 891株微生物完成全基因組測序，其中包含細(xì)菌2 780株、真核微生物121株、古菌107株、病毒2 697株、質(zhì)粒1 186個(gè)。越來越多的微生物開始進(jìn)行全基因組測序[6～13]。

3.2 必需基因的確定

必需基因的確定主要有3種方法：

①利用生物信息學(xué)預(yù)測必需基因[14～17]第一步，利用在線數(shù)據(jù)庫（Database of Essential Genes，DEG，http://tubic.tju.edu.cn/deg/）進(jìn)行分析。將目標(biāo)菌株的全基因組序列和數(shù)據(jù)庫中同類菌株的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，如果遺傳相似性大于50%，則可能為必需基因。

第二步，利用在線分析軟件（http://tubic.tju.edu. cn/GC-Profile/）分析基因組島。分析結(jié)果將全基因組分成N+1個(gè)區(qū)域，N+1個(gè)區(qū)域的 （G+C）%值與全基因組的（G+C）%值進(jìn)行比對，相差較大的可能是基因組島，即可能通過水平轉(zhuǎn)移獲得的基因，可以刪除。

第三步，利用在線分析軟件（http://tubic.tju.edu. cn/Ori-Finder/）分析復(fù)制原點(diǎn)，確定oriC的位置和大小，復(fù)制原點(diǎn)側(cè)翼序列需要保留。

②確立菌株核心編碼區(qū)，確定必需基因 通過選擇同源關(guān)系較遠(yuǎn)的同屬菌株全基因組序列，確定保守核心編碼區(qū)。

③通過計(jì)算機(jī)構(gòu)建模型 將代謝途徑與數(shù)學(xué)符號進(jìn)行對應(yīng)，從而構(gòu)建出全基因組代謝模型[18]。

4 微生物最小基因組縮小常用的技術(shù)手段

對微生物基因組進(jìn)行定點(diǎn)無痕修飾是目前基因組縮小常用的技術(shù)手段，主要包括：①傳統(tǒng)同源重組；②利用λ-Red系統(tǒng)的同源重組；③利用Cre/ loxP切除系統(tǒng)和Tn轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[19～22]。

4.1 大腸桿菌基因組的縮短

大腸桿菌是生物領(lǐng)域被研究得最透徹的模型生物之一，其代謝網(wǎng)絡(luò)也被研究得很清楚，因此被用于科研領(lǐng)域、醫(yī)藥研究、發(fā)酵工業(yè)等，生產(chǎn)重組蛋白、氨基酸或者其他化學(xué)品。2001年，Mizoguchi等[23]利用2個(gè)連續(xù)的λ-Red介導(dǎo)的同源重組（圖1）對Escherichia coliK12菌株進(jìn)行了基因組刪除，突變株MGF-01蘇氨酸的合成能力是野生株的2倍。

圖1 大腸桿菌大片段敲除技術(shù)的原理示意[23]

圖2 枯草芽孢桿菌大片段敲除技術(shù)的原理示意[24]

圖3 鏈霉菌大片段敲除技術(shù)的原理示意[26]

4.2 枯草芽孢桿菌基因組的縮短

枯草芽孢桿菌是一種在土壤中廣泛存在的革蘭氏陽性菌，同蘇云金芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌歸類于日蠟樣芽孢桿菌群。因?yàn)樵摼梢援a(chǎn)生很多具有良好生物活性的次級代謝物，所以被研究得很廣泛。Takuya等[24]2008年通過RecA介導(dǎo)的同源重組（圖 2）對枯草芽孢桿菌的基因組進(jìn)行了縮短， 得到了一系列突變株。 突變株MGB874由于缺少0.87 Mb的基因組序列，表現(xiàn)出良好的特性，該突變株MGB874發(fā)酵液中的纖維素酶和蛋白酶活性均比野生型細(xì)孢高出約1.7倍和2.5倍，同時(shí)還能延長蛋白酶的生產(chǎn)期。

4.3 鏈霉菌基因組的縮短

鏈霉菌是一種應(yīng)用較廣的工業(yè)微生物，能夠合成較豐富的次級代謝產(chǎn)物，如抗生素和一些有應(yīng)用價(jià)值的化合物[25]。Murakami等[26]2007年利用CreloxP的位點(diǎn)特異性重組對鏈霉菌的基因組進(jìn)行了縮短，獲得了一系列的突變體（圖 3）。當(dāng)使用的培養(yǎng)基為鏈霉菌合成阿佛菌素的最佳培養(yǎng)基時(shí)，鏈霉素和頭孢霉素C在突變體菌株中的產(chǎn)量均高于原宿主菌的產(chǎn)量。

5 小結(jié)

目前優(yōu)勢小基因組研究是合成生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。通過基因組縮小研究，能夠構(gòu)建一個(gè)“小且單純”的宿主，來維持外源基因的穩(wěn)定性，以便于大規(guī)模培養(yǎng)。這樣的優(yōu)勢宿主在重組蛋白表達(dá)、基因治療或疫苗載體的制備，以及藥用化合物和大宗化學(xué)品的制備等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值和前景。

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Advances in Minimal Genome Research in Microbial Whole Genome

LIU Xiaoyan1,MIN Yong1,ZHANG Wei2,WANG Kaimei1,WAN Zhongyi1,JIANG Aibing1, ZHANG Guangyang1,CHENG Xianliang1,YANG Ziwen1
(1.National Biopesticide Engineering Research Center,Hubei Biopesticide Engineering Research Center, Hubei Academy of Agricultural Science,Wuhan 430064;2.Hubei Vocational College of Bio-technology)

Minimal genome has become the current research focus of synthetic biology.In this paper,we introduced the necessity and technical methods to carry out the research of minimal genome,and analyzed its application in industrial microbial molecular breeding,in addition,we discussed the development prospect of minimal genome research.

Microbe;Whole genome;Minimal genome;Molecular breeding

Q933；Q344+.13

A

1001-3547（2013）24-0009-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.24.003

劉曉艷（1979-），女，博士，副研究員，主要從事植物病理學(xué)及生物農(nóng)藥分子生物學(xué)研究，電話：027-59101919，E-mail：xiaoyanliu6613@163.com

楊自文，通信作者，電話：027-59101919，E-mail：lky666888@126.com

2013-10-17