肖桂珍，袁芳芳，古正濤，劉志鋒，張亞歷，蘇磊

熱打擊對(duì)單層腸上皮Caco-2細(xì)胞屏障功能的影響

肖桂珍，袁芳芳，古正濤，劉志鋒，張亞歷，蘇磊

目的研究熱打擊對(duì)腸黏膜屏障上皮細(xì)胞間緊密連接及凋亡的影響。方法采用腸上皮細(xì)胞株Caco-2建立腸屏障模型，檢測(cè)經(jīng)37～43℃熱打擊后細(xì)胞的單層跨膜電阻抗(TEER)值及對(duì)大分子物質(zhì)辣根過氧化物酶(HRP)的通透性，采用Western blotting檢測(cè)occludin蛋白的表達(dá)水平，Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果隨著熱打擊溫度的升高，TEER值降低，HRP通透性增加，37℃熱打擊細(xì)胞的TEER值和HRP通透性與39、41、43℃熱打擊細(xì)胞差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。熱打擊溫度從37℃到41℃，occludin蛋白的表達(dá)逐漸增加，于41℃達(dá)峰值，此后逐漸下降。43℃時(shí)隨熱打擊時(shí)間延長，occludin蛋白表達(dá)逐漸降低。隨熱打擊溫度(37～43℃)升高，細(xì)胞凋亡逐漸增加(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論熱打擊可造成腸上皮緊密連接的明顯破壞，細(xì)胞凋亡增加，從而破壞腸屏障功能。

中暑；腸黏膜；細(xì)胞凋亡

中暑是一種威脅生命的機(jī)體狀態(tài)，其特征為核心體溫升高(＞40℃)[1]，可影響包括腸道在內(nèi)的各器官系統(tǒng)功能。相鄰腸上皮細(xì)胞靠上部的緊密連接聚合成機(jī)械屏障，可防止腸腔內(nèi)的病原體和抗原侵入腸黏膜，對(duì)維持腸壁通透性具有重要作用[2]。中暑動(dòng)物模型顯示，體溫升高到40～42℃可導(dǎo)致腸上皮破壞及通透性增高，腸內(nèi)有毒物質(zhì)入血[3]，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙(MODS)，甚至導(dǎo)致死亡[4]。因此，研究腸黏膜屏障功能的破壞機(jī)制、尋找保護(hù)因素對(duì)中暑的預(yù)防和治療意義重大。有研究觀察到熱打擊可破壞細(xì)胞間緊密連接[5]，但并未從蛋白水平以及細(xì)胞凋亡方面對(duì)腸屏障功能進(jìn)行系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞建立腸上皮細(xì)胞模型，探討高溫對(duì)腸屏障的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器 腸上皮細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)，Transwell小室(直徑6.5mm，孔徑3μm，Corning公司)，Annexin V-FITC/PI試劑盒、小鼠抗occludin抗體(BD Biosciences公司)，小鼠抗β-actin抗體(中杉金橋公司)，TMB顯色液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司)，辣根過氧化物酶(HRP，typeⅤ，Sigma公司)，Immobilon Western發(fā)光液(Millipore公司)，空氣恒溫箱(Edison公司)，多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)，細(xì)胞電阻計(jì)(EVOM，World Precision Instruments公司)，BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2熱損傷模型的建立 Caco-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液在5%CO2、37℃、90%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)。取生長至80%～90%融合的細(xì)胞，換液后置于空氣恒溫箱中，調(diào)節(jié)溫度和時(shí)間進(jìn)行熱打擊。打擊結(jié)束后重新置入培養(yǎng)箱中。

1.3細(xì)胞單層跨膜電阻抗(TEER)值檢測(cè) 每個(gè)Transwell小室的上室種植2.0×106個(gè)細(xì)胞，上室和下室分別加入200μl和600μl培養(yǎng)液。取不同的3個(gè)點(diǎn)，將細(xì)胞電阻儀電極的短臂和長臂分別插入上室和下室測(cè)定TEER值。培養(yǎng)至7～14d，待TEER值超過250Ω/cm2后，即可進(jìn)行熱損傷實(shí)驗(yàn)。由于各孔基礎(chǔ)值有差異，將各組熱打擊前的TEER值設(shè)為1，經(jīng)37～43℃持續(xù)1h的熱打擊后，立即測(cè)定TEER值，計(jì)算熱打擊后與熱打擊前TEER值的比值，以TEER(%)表示。

1.4單層細(xì)胞通透性測(cè)定 將Transwell小室中換為去酚紅的DMEM培養(yǎng)液，將辣根過氧化物酶(HRP)加入上室(終濃度3.4×10-6mol/L)。熱打擊后，于下室中取2μl培養(yǎng)基，置于96孔板內(nèi)，加入TMB顯色液，于多功能酶標(biāo)儀370nm波長處讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算HRP濃度，以其占加入總HRP量的百分比(%)表示。

1.5Western blotting檢測(cè) 經(jīng)37～43℃持續(xù)1～4h的熱打擊后，將細(xì)胞培養(yǎng)24h，提取蛋白，BCA試劑盒測(cè)定濃度。取等量樣品蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，以濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后，分別加入小鼠抗occludin抗體(1:500)、小鼠抗β-actin抗體(1:1000)孵育過夜，加入相應(yīng)的二抗(1:3000)孵育2h，采用Immobilon Western發(fā)光液檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.6Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行37～43℃持續(xù)1h的熱打擊，再培養(yǎng)24h；用無EDTA的胰蛋白酶消化，2000r/min離心5min，冷PBS洗2次；取100μl緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI混勻；室溫避光孵育15min后上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA，Bonferroni)，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞單層通透性的改變 經(jīng)過1h的熱打擊，與37℃熱打擊的細(xì)胞相比，39℃、41℃和43℃熱打擊細(xì)胞的TEER值(%)均明顯降低(P＜0.01)。相應(yīng)的隨著溫度升高，下室中大分子物質(zhì)HRP占上室加入量的百分比逐漸增加，與37℃熱打擊細(xì)胞相比差異顯著(P＜0.01)，即從上室漏入下室的HRP增多，表明細(xì)胞間空隙加大，通透性增高(表1)。

表1 溫度升高對(duì)TEER值(%)和大分子物質(zhì)HRP通透性的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of heat stress on TEER(%) and permeability to HRP flux±s, n=6)

表1 溫度升高對(duì)TEER值(%)和大分子物質(zhì)HRP通透性的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of heat stress on TEER(%) and permeability to HRP flux±s, n=6)

(1)P＜0.01 compared with 37℃

Temperature(℃) TEER(%) HRP flux(%) 37 1.025±0.025 0.037±0.002 39 0.921±0.053(1) 0.047±0.002(1)41 0.769±0.050(1) 0.071±0.004(1)43 0.701±0.025(1) 0.132±0.009(1)

2.2緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的變化 經(jīng)37～43℃持續(xù)1h的熱打擊后，從37℃到41℃熱打擊細(xì)胞的occludin蛋白表達(dá)逐漸增加，在41℃時(shí)達(dá)高峰，而當(dāng)溫度繼續(xù)上升，其表達(dá)反而下降(圖1A)。進(jìn)行43℃的熱打擊，時(shí)間從1h增加至4h，occludin蛋白表達(dá)逐漸降低，且呈時(shí)間依賴性(圖1B)。

2.3熱打擊對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 進(jìn)行37～43℃持續(xù)1h的熱打擊后，與37℃熱打擊細(xì)胞相比，39、41、43℃熱打擊細(xì)胞的凋亡細(xì)胞明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，表明熱打擊可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并隨溫度的升高而增強(qiáng)(表2，圖2)。

圖1 溫度升高及時(shí)間延長對(duì)occludin蛋白的表達(dá)影響Fig.1 Effects of heat stress on expression of tight junction protein occludin

表2 溫度升高對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effects of heat stress on apoptosis (%±s, n=3)

表2 溫度升高對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effects of heat stress on apoptosis (%±s, n=3)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with 37℃

Temperature(℃) Early apoptosis cell Non-viable apoptosis cell 37 1.47±0.05 7.15±0.14 39 2.95±0.17(2) 8.43±0.40(1)41 10.02±0.20(2) 16.28±0.20(2)43 18.44±0.58(2) 22.69±0.54(2)

圖2 溫度升高對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of heat stress on apoptosis

3 討 論

腸道上皮組織將機(jī)體內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境分開，可有效抵抗外源性病原菌和毒素的入侵。多種有害因素可引起腸上皮細(xì)胞破壞，腸黏膜損傷、萎縮，黏膜屏障功能障礙，造成腸道通透性增加[6]，使腸腔內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素進(jìn)入血液，炎癥因子釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)和腸源性感染[7]。本實(shí)驗(yàn)使用源于腸腺癌的Caco-2細(xì)胞建立腸上皮細(xì)胞屏障模型，該細(xì)胞因可形成類似于腸黏膜單層上皮緊密連接的結(jié)構(gòu)，接近正常腸上皮的功能特點(diǎn)，近20年來被廣泛用于研究腸上皮緊密連接的體外模型中[8]。

緊密連接是由一系列蛋白、脂肪組成的復(fù)合體，位于腸上皮細(xì)胞頂端，呈環(huán)狀連續(xù)地圍繞于相鄰細(xì)胞周圍，封閉細(xì)胞之間的空隙，是機(jī)械屏障的主要組成部分，可有效阻止微生物以及一些有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，腸黏膜屏障破壞常伴隨腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的改變。腸上皮緊密連接與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，緊密連接結(jié)構(gòu)一旦受損，腸上皮細(xì)胞間的通透性增加，就會(huì)使細(xì)菌和有害物質(zhì)等進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，造成炎癥反應(yīng)[9-10]。內(nèi)毒素移位與中暑的疾病進(jìn)程有直接關(guān)系，Lambert[11]研究發(fā)現(xiàn)，高體溫可破壞腸上皮細(xì)胞膜，使緊密連接開放，腸道屏障功能破壞，對(duì)大分子物質(zhì)的通透性增加，導(dǎo)致腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素從相鄰的上皮細(xì)胞間隙進(jìn)入，觸發(fā)熱射病。相反，抗內(nèi)毒素的抗體對(duì)受熱打擊的動(dòng)物有保護(hù)作用，還可阻止病理進(jìn)程由熱損傷向中暑轉(zhuǎn)變[12]。因此，維持緊密連接的正常結(jié)構(gòu)，保護(hù)腸屏障功能是預(yù)防中暑發(fā)生和發(fā)展的主要目標(biāo)之一。

體外試驗(yàn)中，單層細(xì)胞的TEER值是反映腸黏膜屏障通透性的主要指標(biāo)之一，與細(xì)胞單層通透性呈負(fù)相關(guān)。如果細(xì)胞完整性受損，則TEER值下降，同時(shí)對(duì)HRP的通透性升高，HRP通過受損的細(xì)胞間空隙漏入下室增多。本研究中，上述兩個(gè)指標(biāo)的變化都表明熱打擊破壞了腸上皮細(xì)胞的屏障功能。

緊密連接區(qū)域的特異性蛋白包括跨膜蛋白o(hù)ccludin、膜蛋白ZO-1以及claudin蛋白家族等，這些蛋白表達(dá)下調(diào)時(shí)，緊密連接結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，腸道屏障功能受損。其中，occludin蛋白是一種跨膜蛋白，參與體內(nèi)多種屏障結(jié)構(gòu)的形成，位于細(xì)胞間緊密連接的縫隙處，在調(diào)控細(xì)胞間的通透性和信號(hào)傳導(dǎo)方面有重要意義[13]，其表達(dá)下調(diào)會(huì)引起腸上皮細(xì)胞通透性明顯增加[14]。但是，以往研究發(fā)現(xiàn)，以39℃和41℃的高溫分別刺激腸上皮Caco-2細(xì)胞，occludin表達(dá)隨打擊溫度升高和打擊時(shí)間延長而上升，同時(shí)細(xì)胞旁通透性增加，推測(cè)occludin上調(diào)是腸細(xì)胞的保護(hù)性反應(yīng)[15]。本研究顯示，溫度從37℃上升到41℃時(shí)，occludin表達(dá)上升，這一結(jié)果與既往研究一致，但溫度繼續(xù)升高時(shí)，occludin的表達(dá)反而下降，而且在43℃條件下，隨時(shí)間延長呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)，表明occludin表達(dá)并不能無限制地增加而保護(hù)和維持緊密連接結(jié)構(gòu)，如果熱打擊的溫度上升到一定閾值，緊密結(jié)構(gòu)也會(huì)遭到破壞，因此在高溫時(shí)能否上調(diào)occludin表達(dá)可作為判定保護(hù)性因素的標(biāo)準(zhǔn)之一。

細(xì)胞凋亡對(duì)確保機(jī)體的生長發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要作用。腸黏膜上皮正常結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定有賴于細(xì)胞增殖和凋亡間的平衡[16]。腸黏膜上皮細(xì)胞的過度凋亡可減弱腸上皮的再生與修復(fù)，引起腸黏膜上皮缺損，造成屏障功能障礙，使細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)缺損處進(jìn)入體循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌、內(nèi)毒素、氧自由基及腸道缺血/再灌注損傷均可引起腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)伴有腸黏膜屏障功能障礙，且通透性與凋亡指數(shù)呈正相關(guān)[17]。本研究的結(jié)果顯示，熱打擊誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡明顯增加，且隨著溫度升高，凋亡細(xì)胞數(shù)上升，表明熱打擊可以通過誘導(dǎo)腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡損傷腸黏膜屏障。因此可以推測(cè)，細(xì)胞凋亡率上升是熱打擊后早期腸屏障功能障礙的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，熱打擊可通過改變occludin蛋白功能及增加細(xì)胞凋亡影響緊密連接、增加上皮缺損，使單層腸上皮細(xì)胞TEER值下降，對(duì)大分子物質(zhì)的通透性增加，黏膜屏障功能下降。因此，保護(hù)腸屏障，減少由此而產(chǎn)生的腸源性感染是減少中暑后炎癥反應(yīng)和死亡率的重要機(jī)制。

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Effect of heat stress on intestinal barrier function of human intestinal epithelial Caco-2 cells

XIAO Gui-zhen1, YUAN Fang-fang2, GU Zheng-tao2, LIU Zhi-feng2, ZHANG Ya-li1*, SU Lei2*
1Key Laboratory of Gastroenterology of Guangdong Province, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
2Key Laboratory of Hot Zone Trauma Care and Tissue Repair of PLA, Department of Intensive Care Unit, General Hospital of Guangzhou Command, Guangzhou 510010, China
*

. ZHANG Ya-li, E-mail: zyl41531@163.com; SU Lei, E-mail: slei_icu@163.com
This work was supported by the grant from National Natural Science Foundation of China (81071529)

ObjectiveTo investigate the heat stress-induced dysfunction of intestinal barrier including intestinal tight junction and apoptosis of epithelial cells.MethodsHuman intestinal epithelial Caco-2 cell monolayers, serving as the intestinal barrier model, were exposed to different temperature (37-43℃) for designated time. Transepithelial electrical resistance (TEER) and horseradish peroxidase (HRP) flux permeability were measured to evaluate barrier integrity. Level of tight junction (TJ) protein occludin was analyzed by Western blotting. Cell apoptosis rate was determined using Annexin V-FITC/PI kit by flow cytometry.ResultsCompared with the 37℃ group, TEER lowered and the permeability for HRP increased significantly after heat exposure (P＜0.01) in 39℃, 41℃ and 43℃ groups. The expression of occludin increased when the temperature was elevated from 37℃to 41℃, and it reached the maximal level at 41℃. However, its expression gradually decreased with passage of time at 43℃. Cell apoptosis was enhanced with elevation of the temperature (P＜0.05 orP＜0.01).ConclusionHeat stress can induce damage to tight junction and enhance apoptosis of epithelial cells, thus causing dysfunction of intestinal epithelial barrier.

heat stroke; intestinal mucosa; apoptosis

R594.12

A

0577-7402(2013)06-0472-04

2013-01-17；

2013-04-20)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

國家自然科學(xué)基金(81071529)

肖桂珍，博士研究生。主要從事危重患者腸屏障功能的基礎(chǔ)與臨床研究

510515 廣州 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化病研究所(肖桂珍、張亞歷)； 510010 廣州 全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(袁芳芳、古正濤、劉志鋒、蘇磊)

張亞歷，E-mail: zyl41531@163.com；蘇磊，E-mail: slei_icu@163.com