范曉艷 呂冬霞 姚海濤 金岳雷 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

隨著細(xì)胞凋亡研究的不斷深入，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物也不斷被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究更成為研究的熱點(diǎn)。五味子乙素(schisandrin B，SchB)系木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)的提取物，劉力生等〔1〕研究顯示SchB對(duì)小鼠免疫功能、腹水型肝癌細(xì)胞DNA合成具有抑制作用。順鉑是一種類(lèi)烷化劑的金屬鉑類(lèi)化合物，為常用的化療藥物。本實(shí)驗(yàn)將SchB與順鉑聯(lián)合作用于H22小鼠實(shí)體瘤，觀察兩者聯(lián)合作用后p53的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料 SohB成都巨邦生物工程有限公司惠贈(zèng);順鉑:中國(guó)山東省德州制藥廠，批號(hào)20070516;實(shí)驗(yàn)瘤源小鼠:H22腹水瘤小鼠購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院動(dòng)物中心;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明種近交系小鼠，體重(20±2.0)g，雄性，佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):黑動(dòng)字第99101001，普通級(jí)，普通環(huán)境飼養(yǎng)。p53免疫組化試劑盒:武漢博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與用藥 將接種H22瘤種8 d的腹水瘤小鼠以脫頸法處死，無(wú)菌條件下抽取腹水瘤細(xì)胞懸液5 ml，經(jīng)離心稀釋?zhuān)蒙睇}水重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度為1×1010/L。以0.2 ml/只接種于被試的40只昆明種小鼠右腋下，制成實(shí)體瘤動(dòng)物模型。于接種24 h后，將40只被試小鼠隨機(jī)分成4組:單純順鉑組、單純SchB組、SchB聯(lián)合順鉑組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)聯(lián)合組)和對(duì)照組。順鉑用生理鹽水溶解后按2.5 mg/kg腹腔注射，SchB用生理鹽水溶解后按200 mg/kg灌胃。腹腔注射劑量為0.2 ml，灌胃劑量為0.4 ml，連續(xù)處理7 d。單純順鉑組:早上腹腔注射順鉑，晚上生理鹽水灌胃;單純SchB組:早上生理鹽水腹腔注射，晚上SchB灌胃;SchB聯(lián)合順鉑組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)聯(lián)合組):早上腹腔注射順鉑，晚上SchB灌胃。對(duì)照組:早上生理鹽水腹腔注射，晚上生理鹽水灌胃。

1.2.2 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài) 接種后第9天處死小鼠，剖出完整的腫瘤組織，用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗，最后進(jìn)行常規(guī)HE染色，在顯微成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.2.3 p53表達(dá)檢測(cè) 分離出實(shí)體瘤組織，肉眼下切取無(wú)壞死1 mm3腫瘤組織2塊，用10%甲醛固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。免疫組化用常規(guī)親和素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合體(SABC)法，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:分別觀察制片后的p53表達(dá)，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或褐色為半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿和胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色為p53陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。顯微鏡下選取每個(gè)區(qū)域不重復(fù)隨機(jī)10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算p53陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng) 用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合用藥對(duì)小鼠H22實(shí)體瘤細(xì)胞形態(tài) 鏡下觀察，與對(duì)照組比較，用藥組出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞減少，并大面積壞死;染色質(zhì)固縮濃染，有的呈半月形，緊貼于核膜周邊，部分細(xì)胞裂解為碎片狀。細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變見(jiàn)圖1。

圖1 聯(lián)合用藥組(HE，×400)

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)p53表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單純順鉑組與單純SchB組p53的陽(yáng)性率與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)，且聯(lián)合組與對(duì)照組比較差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。方差分析顯示單純順鉑組與單純SchB組間p53差異無(wú)顯著性，聯(lián)合組抑瘤率明顯高于單純順鉑組及單純SchB組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各抗腫瘤藥物對(duì)H22小鼠實(shí)體瘤p53表達(dá)影響(%)

3 討論

凋亡細(xì)胞〔2〕的形態(tài)學(xué)改變可分為三個(gè)階段:①凋亡起始階段的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化主要是有完整細(xì)胞膜，但特化結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞間的接觸消失，仍然有選擇透性;染色質(zhì)出現(xiàn)固縮，沿著核膜分布，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)。②第二階段形成凋亡小體。核染色質(zhì)發(fā)生斷裂，形成大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍。從外觀上看，細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起。以后，逐漸分離，形成單個(gè)的凋亡小體。③凋亡小體逐漸為臨近的細(xì)胞所吞噬并消化〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腫瘤的HE染色，在顯微鏡下觀察顯示存在細(xì)胞凋亡，說(shuō)明SchB五味子乙素可促進(jìn)H22腫瘤細(xì)胞凋亡。

p53是一種抑癌基因，與多種基因之間構(gòu)成p53基因網(wǎng)絡(luò)，有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、維持基因組穩(wěn)定等功能〔4〕。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DNA受損時(shí)，p53蛋白表達(dá)水平增高，導(dǎo)致細(xì)胞增殖終止，使受損的細(xì)胞獲得修復(fù)DNA的時(shí)間，假如無(wú)法修復(fù)，那么p53蛋白將持續(xù)增高，從而引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SchB聯(lián)合順鉑抑制腫瘤生長(zhǎng)與p53高表達(dá)有關(guān)。

顧穎等〔5〕研究表明SchB可促進(jìn)多柔比星誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)凋亡，梁軍等〔6〕研究 SchB對(duì)人胃癌細(xì)胞株(MGC-803)凋亡的影響。本實(shí)驗(yàn)表明了SchB聯(lián)合順鉑可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，將進(jìn)一步研究?jī)烧呗?lián)合作用抑制腫瘤的機(jī)制，為SchB聯(lián)合順鉑在臨床應(yīng)用提供更有力的依據(jù)。

1 劉力生，王 勤，鄭榮梁，等.五味子乙素對(duì)小鼠免疫功能、腹水型肝癌細(xì)胞DNA合成和存活率的作用〔J〕.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1990;5(1):55-9.

2 呂冬霞.細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)〔M〕.北京:科學(xué)出版社，2010:138.

3 翟中和，王喜忠，丁明孝.細(xì)胞生物學(xué)〔M〕.北京:高等教育出版社，2000:455-7.

4 Vogelstein B，Lane D，Levine AJ.Surfing the p53 network〔J〕.Nature，2000;408(6810):307-10.

5 顧 穎，李 凌.五味子乙素促進(jìn)多柔比星誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721凋亡的研究〔J〕.實(shí)用腫瘤雜志，2006;21(5):412-6.

6 梁 軍，宋曉玉，劉志新，等.五味子乙素對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803凋亡的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(1):88-90.