劉 軻 李建生 郜利霞 宋張杰 楊歆科 韓向輝 劉敬霞 劉政國 周友龍

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

研究證實(shí)〔1，2〕，腦梗死患者腦組織內(nèi)存在不同程度新生微血管密度的增加，且血管密度高的腦梗死患者預(yù)后明顯好于血管密度低的患者，提示缺血區(qū)血管增生的范圍與程度直接關(guān)系到腦梗死患者的預(yù)后，新形成的側(cè)支血管可以改善缺血區(qū)周圍的組織灌流，可促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)。因而，有關(guān)腦缺血后微血管生成作用機(jī)制的研究備受學(xué)者關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素(Ang)及其受體酪氨酸激酶型受體(Tie-2)系統(tǒng)對腦缺血后微血管的生成發(fā)揮重要作用。本課題觀察腦缺血/再灌注(I/R)腦微血管密度(MVD)、血管場面積以及Ang/Tie-2系統(tǒng)的蛋白與基因的表達(dá)變化，探討Ang/Tie-2系統(tǒng)對腦IR損傷后腦微血管生成的影響及促血管生成的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性青年大鼠5～6月齡44只，300～350 g，動(dòng)物合格證號:醫(yī)動(dòng)字第410117號，SD雄性老齡大鼠20～21月齡 44只，450～600 g，動(dòng)物合格證號:醫(yī)動(dòng)字第410117號，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，室溫控制在26℃ ±1℃的范圍內(nèi)，相對濕度40% ～60%，每天給予充足的清潔飲水和飼料。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗鼠單克隆抗體CD34、過氧化酶SP試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供;兔抗鼠單克隆Ang-1抗體、兔抗鼠單克隆Ang-2抗體、兔抗鼠單克隆Tie-2抗體及Ang-1原位雜交檢測試劑盒、Ang-1原位雜交檢測試劑盒、Tie-2原位雜交檢測試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司

提供;Olympus BX51顯微鏡、Olympus DP70圖像采集系統(tǒng)均由日本奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn);Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)由美國Media Cybernetics公司提供。

1.3 動(dòng)物分組與處理 本實(shí)驗(yàn)設(shè)青年假手術(shù)組、青年模型組(根據(jù) I/R 時(shí)間不同又分為 I 3 h，I/R 1、3、6、12 d 組);老齡假手術(shù)組、老齡模型組(觀察時(shí)點(diǎn)同青年模型組)。青年大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分組，老齡大鼠按體重結(jié)合隨機(jī)數(shù)字分組，每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)6只。

1.4 模型制備 參照Longa等〔3，4〕報(bào)道的方法加以改進(jìn)。

1.5 指標(biāo)觀察與檢測方法

1.5.1 微血管密度(MVD)及血管場面積檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法。常規(guī)石蠟切片厚5 μm，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗。滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育10～30 min。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色。陰性對照組用PBS代替一抗進(jìn)行孵育。血管內(nèi)皮細(xì)胞膜棕黃色顆粒者為CD34染色陽性。凡呈現(xiàn)單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇者均為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑，或帶有較厚基層的血管均不計(jì)數(shù)。選取大腦皮質(zhì)缺血周邊區(qū)、中心區(qū)每個(gè)區(qū)域內(nèi)5～10個(gè)鏡下高倍視野(400倍)進(jìn)行血管計(jì)數(shù)，表示MVD。采用全自動(dòng)彩色圖像處理系統(tǒng)測定血管場面積比，血管場面積比為所測有效血管截面面積與統(tǒng)計(jì)場面積的千分比。

1.5.2 Ang-1、Ang-2和Tie-2蛋白檢測 采用免疫組化法測定，常規(guī)石蠟切片厚5 μm。3%H2O2室溫孵育10 min，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗。滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育10～30 min。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色。陰性對照采用PBS替代第一抗體進(jìn)行。胞漿或胞膜棕黃色染色者為陽性細(xì)胞。在大腦皮質(zhì)缺血周邊區(qū)、中心區(qū)選取5～10個(gè)高倍鏡下(400倍)視野進(jìn)行觀察并攝片。采用全自動(dòng)彩色圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測定陽性反應(yīng)的灰度值。1.5.3 Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA檢測 采用原位雜交法檢測，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，胃蛋白酶消化后固定，進(jìn)行預(yù)雜交，然后雜交，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加生物素化SP，DAB顯色，雜交結(jié)果進(jìn)行分析，并采用全自動(dòng)彩色圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測定陽性反應(yīng)的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MVD及血管場面積變化 青年模型組I/R 1、3、6、12 d大鼠MVD均高于青年假手術(shù)組(P＜0.01)，老齡模型組I/R 6、12 d大鼠MVD均低于老齡假手術(shù)組(P＜0.05，P＜0.01);與青年組同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡假手術(shù)組MVD增高(P＜0.01)，老齡模型組 I/R 1、3、6、12 d大鼠 MVD 均降低(P ＜0.05，P＜0.01)。老齡模型組大鼠MVD自缺血3 h持續(xù)降低至I/R 12 d;青年模型組大鼠MVD于缺血3 h開始增高，I/R 6 d達(dá)高峰，持續(xù)至 I/R 12 d。青年模型組 I/R 1、3、6、12 d 大鼠血管場面積均高于青年假手術(shù)組(P＜0.01)，老齡模型組I/R 1 d大鼠血管場面積高于老齡假手術(shù)組(P＜0.05);與青年動(dòng)物組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡模型組I/R 1、3、6、12 d大鼠血管場面積均降低(P＜0.01)。青年模型組I/R 1 d大鼠血管場面積明顯增高，I/R 1～6 d逐漸降低，至I/R 12 d又明顯增高;老齡模型組大鼠血管場面積于I/R 1 d達(dá)峰值，后逐步降低。見表1。

表1 各組大鼠MVD、血管場面積變化比較(，n=6)

表1 各組大鼠MVD、血管場面積變化比較(，n=6)

與同齡假手術(shù)組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與青年假手術(shù)組比較:3)P＜0.01;與青年I/R同時(shí)間點(diǎn)比較:4)P＜0.05，5)P＜0.01

組別 時(shí)點(diǎn) MVD(個(gè)) 血管場面積(‰)青年假手術(shù)組5.50±1.53 23.37±7.90青年模型組 I 3 h 5.96±1.65 27.16±5.55 I/R 1 d 7.50±1.871) 36.27±12.241)I/R 3 d 9.75±2.311) 35.17±10.481)I/R 6 d 10.13±2.091) 31.34±8.331)I/R 12 d 10.00±1.961) 39.42±14.301)老齡假手術(shù)組 6.88±1.603) 23.97±5.46老齡模型組 I 3 h 6.63±1.53 25.10±6.58 I/R 1 d 6.50±1.594) 28.24±5.682)I/R 3 d 6.04±1.275) 24.97±7.115)I/R 6 d 5.71±1.762)5) 21.83±6.685)I/R 12 d 5.29±1.121)5) 20.64±6.565)

2.2 各組大鼠Ang-1、Ang-2及Tie-2表達(dá)變化 見表2。

2.2.1 Ang-1表達(dá)變化 青年及老齡模型組I/R 1、3、6、12 d大鼠Ang-1表達(dá)均高于青年及老齡假手術(shù)組(P＜0.01);青年及老齡模型組大鼠Ang-1表達(dá)均隨再灌注時(shí)間延長而逐漸增高，于I/R 3 d達(dá)到峰值，其后逐漸降低;與青年動(dòng)物組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡動(dòng)物組各時(shí)間點(diǎn)Ang-1表達(dá)均降低(P＜0.01，P ＜0.05)。

2.2.2 Ang-2表達(dá)變化 青年及老齡模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠Ang-2表達(dá)均高于較青年及老齡假手術(shù)組(P＜0.01);青年模型組Ang-2表達(dá)持續(xù)增高到I/R 3 d達(dá)峰值，I/R 3～12 d表達(dá)逐漸降低;老齡模型組Ang-2隨再灌注時(shí)間延長表達(dá)逐漸增高，I/R 1 d達(dá)到峰值，逐步降低至I/R 3 d，至I/R 6 d表達(dá)又稍有增高，此后明顯降低;與青年動(dòng)物組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡動(dòng)物組I/R 1 d大鼠Ang-2表達(dá)增高(P＜0.01)，其余各時(shí)間點(diǎn)Ang-2表達(dá)均降低(P＜0.01)。

2.2.3 Tie-2表達(dá)變化 青年模型組 I3 h、I/R 1、3、6 d大鼠Tie-2表達(dá)均高于青年假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.05)，老齡模型組I3 h、I/R 1、3 d大鼠Tie-2表達(dá)均高于老齡假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.05);青年和老齡模型組Tie-2表達(dá)均隨再灌注時(shí)間的延長而逐步增高，老齡模型組提前至I/R 1 d達(dá)峰值，此后老齡模型大鼠表達(dá)迅速降低，而青年模型組至I/R 12 d仍維持一個(gè)相對高的表達(dá)水平。與青年動(dòng)物組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡動(dòng)物組I/R 3、6、12 d大鼠Tie-2表達(dá)降低(P＜0.01)。

2.3 各組大鼠Ang-1 mRNA、Ang-2 mRNA及Tie-2 mRNA表達(dá)變化 見表3。

2.3.1 Ang-1 mRNA表達(dá)變化 青年及老齡模型組I/R 1、3、

6、12 d大鼠Ang-1 mRNA表達(dá)均高于青年及老齡假手術(shù)組(P＜0.01);青年及老齡模型組大鼠Ang-1 mRNA表達(dá)均隨再灌注時(shí)間延長而逐漸增高，于I/R 3 d達(dá)到峰值，其后逐漸降低;與青年動(dòng)物組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡動(dòng)物組各時(shí)間點(diǎn)Ang-1 mRNA表達(dá)均降低(P＜0.01，P＜0.05)。

2.3.2 Ang-2 mRNA表達(dá)變化 青年和老齡模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠Ang-2 mRNA表達(dá)均高于老齡假手術(shù)組(P＜0.05，P＜0.01);青年和老齡模型組隨再灌注時(shí)間的延長表達(dá)逐步增高，I/R 1 d達(dá)到峰值，老齡大鼠I/R 1～3 d表達(dá)逐步降低，I/R 3～12 d表達(dá)又逐步增高，而青年大鼠I/R 1～6 d表達(dá)逐步降低，I/R 6～12 d表達(dá)逐步增高。與青年動(dòng)物組相同時(shí)點(diǎn)比較，老齡假手術(shù)組、老齡模型組I 3 h、I/R 1、3、12 d表達(dá)水平均降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3.3 Tie-2 mRNA表達(dá)變化 青年模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠Tie-2 mRNA表達(dá)均低于青年假手術(shù)組(P＜0.01)，老齡模型組I 3 h、I/R 1、3 d大鼠 Tie-2 mRNA表達(dá)均高于青年假手術(shù)組(P＜0.05，P＜0.01);青年和老齡模型組Tie-2表達(dá)均隨再灌注時(shí)間的延長而逐步增高，二者均于I/R 3 d達(dá)峰值，此后老齡模型大鼠表達(dá)迅速降低，而青年模型組至I/R 12 d仍維持一個(gè)相對高的表達(dá)水平;與青年動(dòng)物組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡動(dòng)物組各時(shí)間點(diǎn)Tie-2 mRNA表達(dá)均降低(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 各組大鼠Ang-1、Ang-2及Tie-2表達(dá)變化(，n=6)

表2 各組大鼠Ang-1、Ang-2及Tie-2表達(dá)變化(，n=6)

組別 Ang-1(灰度值) Ang-2(灰度值) Tie-2(灰度值)青年假手術(shù)組178.75±4.36 187.71±2.74 182.98±5.04青年模型組I 3 h 188.14±5.211) 176.02±4.841) 175.77±3.332)I/R 1 d 172.10±4.112) 165.63±1.811) 169.88±4.251)I/R 3 d 160.39±3.521) 141.24±1.281) 161.11±2.511)I/R 6 d 166.77±3.991) 149.80±3.961) 170.76±3.371)I/R 12 d 170.31±2.152) 162.51±2.401) 179.88±3.40老齡假手術(shù)組 182.01±3.773) 194.53±4.333) 190.76±3.443)老齡模型組I 3 h 195.18±5.181) 185.98±4.451) 181.56±5.212)I/R 1 d 179.02±5.162)5) 150.53±5.451)5) 163.95±4.381)4)I/R 3 d 162.45±2.921) 171.27±3.901)5) 174.29±3.621)5)I/R 6 d 170.73±3.151) 159.73±3.171)5) 189.62±4.825)I/R 12 d 175.85±3.031)4) 177.85±3.011) 198.29±6.872)5)

表3 各組大鼠Ang-1 mRNA、Ang-2 mRNA及Tie-2 mRNA表達(dá)變化(，n=6)

表3 各組大鼠Ang-1 mRNA、Ang-2 mRNA及Tie-2 mRNA表達(dá)變化(，n=6)

組別Ang-1 mRNA(灰度值)Ang-2 mRNA(灰度值)Tie-2 mRNA(灰度值)青年假手術(shù)組179.70±6.20 188.81±6.20 181.37±4.93青年模型組I 3 h 190.31±6.301) 169.96±6.031) 171.85±4.781)I/R 1 d 167.40±8.291) 130.51±11.301) 163.90±5.631)I/R 3 d 155.84±5.791) 146.52±7.381) 149.96±5.201)I/R 6 d 160.06±7.001) 163.07±6.881) 166.46±5.011)I/R 12 d 169.98±7.071) 146.08±4.741) 170.91±4.701)老齡假手術(shù)組 191.40±4.043) 213.96±4.273) 185.80±4.95老齡模型組I 3 h 204.68±5.091) 200.22±7.742) 178.78±2.372)I/R 1 d 182.86±7.391)5) 145.51±7.831)4) 169.63±6.661)4)I/R 3 d 162.88±9.351)4) 177.94±4.711)5) 158.95±6.141)5)I/R 6 d 173.92±6.251)5) 169.84±11.051)5) 187.83±7.895)I/R 12 d 183.19±7.571)5) 163.22±7.981)5) 194.22±4.911)5)

3 討論

腦缺血后的血管生成是一個(gè)復(fù)雜的精細(xì)的調(diào)控過程，研究證實(shí)〔5〕，腦缺血后機(jī)體“自身代償性血管生成”所形成的側(cè)支循環(huán)，是由局部組織釋放的內(nèi)源性促血管生長因子所引起的，這些因子在腦缺血后微血管生成過程中發(fā)揮著重要作用。Plate〔6〕亦認(rèn)為腦血管生成受神經(jīng)外胚胎層來源的血管生成生長因子與內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的酪氨酸激酶受體結(jié)合而調(diào)節(jié)。大鼠腦血管生成在出生20 d后即可完成，但在病理情況下，如腦血管缺血、缺氧、腦腫瘤生長，內(nèi)皮細(xì)胞在成年后仍可增殖，血管的增殖有賴于血管生長因子的表達(dá)和相互協(xié)同。在此過程中，這些因子及其受體家族通過不同途徑的協(xié)同作用，促進(jìn)腦缺血后的血管生成和腦損傷的恢復(fù)，其中有關(guān)Ang及其受體Tie-2的研究備受關(guān)注。

Ang是一組特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，該家族主要由Ang-1、Ang-2、Ang-3和 Ang-4四種因子組成，其中Ang-1與Ang-2具有同源性，與血管生成關(guān)系密切。Ang受體Tie是血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異的酪氨酸激酶型受體，Tie-1和Tie-2是該家族的2個(gè)主要成員，目前研究發(fā)現(xiàn)Tie-1不具備酪氨酸激酶功能，尚未發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的配體，而Tie-2受體能被其配體Ang家族識別，Ang-1和Ang-2能特異性與Tie-2結(jié)合，在血管生成中Ang/Tie系統(tǒng)通過正負(fù)協(xié)同作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。目前研究認(rèn)為Ang-1為Tie-2受體的激動(dòng)劑，Tie-2與Ang-1結(jié)合后，使其磷酸化而被激活，在血管生成中的作用主要是〔7～13〕:①抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活;②抑制內(nèi)皮細(xì)胞的通透性;③促進(jìn)血管的芽生和分支，募集內(nèi)皮周圍支持細(xì)胞，促進(jìn)血管重塑和成熟，形成完整的細(xì)胞壁，維持血管的完整性和穩(wěn)定性。Ang-2同樣特異結(jié)合于血管內(nèi)皮Tie-2受體，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)Ang-2是Tie-2受體的拮抗劑，Ang-2與 Tie-2受體結(jié)合后，競爭性的抑制Ang-1激活Tie-2的效應(yīng)，引起血管穩(wěn)定的破壞，促使血管結(jié)構(gòu)松解，解除血管周細(xì)胞、胞外基質(zhì)對內(nèi)皮的抑制，促進(jìn)血管退化〔14，15〕。但由于Ang-2破壞內(nèi)皮細(xì)胞與外周基質(zhì)間的作用，使不穩(wěn)定狀態(tài)的血管內(nèi)皮、基質(zhì)對生長因子的敏感性增強(qiáng)，又可以加強(qiáng)VEGF的促血管生成作用，從而誘導(dǎo)血管重建。而最近研究顯示〔14，15〕，Ang-2 可能在缺少 Ang-1、延長 Ang-2 作用時(shí)間或加大濃度等特定情況下也可激活Tie-2。Ang/Tie系統(tǒng)通過相互協(xié)調(diào)作用參與血管生成的調(diào)節(jié)過程。另外，MVD表示的是單位面積內(nèi)血管的數(shù)量，血管場面積為一個(gè)視野內(nèi)所有微血管管腔面積陽性染色總和與背景視野面積的比值，可較為客觀地反映微血管管腔大小。血管數(shù)量及管腔粗細(xì)為反映血流量及血管有效性的重要指標(biāo)，故對此兩指標(biāo)進(jìn)行觀察，能較全面地反映血管生成的全貌。因此，本實(shí)驗(yàn)為了更好闡釋Ang/Tie系統(tǒng)對血管生成的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對MVD及血管場面積進(jìn)行了研究。

本研究結(jié)果說明腦缺血損傷后青年大鼠不僅血管數(shù)量有增加，而且血管腔直徑也增粗，血液供給量明顯改善。而老齡模型組大鼠血管場面積于I/R 1 d時(shí)達(dá)峰值，隨后逐步降低，說明了老齡大鼠腦MVD降低的同時(shí)也伴隨有血管腔徑的明顯縮小，從而使血液有效灌注量降低。

本實(shí)驗(yàn)中，青年與老齡模型組Ang/Tie-2表達(dá)主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，而且集中于缺血半暗帶區(qū)，這可能是在損傷早期缺血中心區(qū)的細(xì)胞在缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的作用下促使Ang/Tie-2的表達(dá)，由于缺血中心區(qū)與半暗帶區(qū)之間存在著氧濃度梯度，隨著缺血時(shí)間的延長，中心區(qū)細(xì)胞很快崩解壞死，而缺血半暗帶區(qū)仍屬于保存能量代謝的部位，HIF可持續(xù)在此區(qū)表達(dá)，從而引起Ang/Tie-2的表達(dá)向缺血半暗帶區(qū)轉(zhuǎn)移。由此我們認(rèn)為，在一定程度上Ang/Tie-2的表達(dá)上調(diào)與缺血缺氧因素有關(guān)。另外，結(jié)合青、老齡模型組大鼠MVD變化規(guī)律，我們發(fā)現(xiàn)老齡大鼠腦缺血損傷初期MVD較青年大鼠增多，可能由于增齡的因素，老齡大鼠血管變脆變硬，腦組織缺血缺氧逐漸加重，而缺血缺氧又為促Ang/Tie-2表達(dá)的因素，在此因素的作用下，為抵御腦缺血改變，老齡大鼠腦組織內(nèi)逐漸有新血管形成。

本研究動(dòng)態(tài)觀察了Ang/Tie-2系統(tǒng)表達(dá)變化，免疫組化結(jié)果顯示:青年模型組I3h大鼠Ang-1的表達(dá)下調(diào)，而Ang-2及受體Tie-2的表達(dá)均于13 h即表達(dá)上調(diào)，此后Ang-1、Ang-2、Tie-2三者表達(dá)均上調(diào)至I/R 3 d達(dá)高峰，隨后稍有下降，仍保持較高水平的表達(dá)(僅于所選取的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)觀察結(jié)果);而老齡模型組大鼠Ang-1、Ang-2及受體Tie-2的表達(dá)于I/R 1 d或3 d至高峰，隨后迅速下降。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測，在缺血早期大鼠Ang-1與Ang-2、Tie-2的表達(dá)規(guī)律似乎不一致，這可能與Ang-2的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，由于Ang-2是Ang-1的天然拮抗劑，可以競爭性抑制Ang-1與Tie-2的結(jié)合，然而在缺乏Ang-1的條件下，Ang-2則發(fā)揮激活Tie-2的作用，致使Tie-2隨著Ang-2的表達(dá)上調(diào)而增加，這一結(jié)果與Yuan等〔14〕研究基本一致，此后隨著Ang-1、Ang-2等相關(guān)血管生長因子的表達(dá)上調(diào)至高峰，Tie-2的表達(dá)亦隨之達(dá)峰值，表明它們相互作用和影響，在時(shí)間上協(xié)同調(diào)節(jié)血管生成。此外，本實(shí)驗(yàn)中，與青年大鼠相比，老齡大鼠Ang/Tie-2表達(dá)峰值提前，此可能與老齡大鼠腦I/R后損傷重，細(xì)胞凋亡變性快，組織超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重等有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中原位雜交結(jié)果顯示:青年及老齡模型組大鼠Ang-1 mRNA、Tie-2 mRNA的表達(dá)均于I/R 3 d至高峰，隨后表達(dá)降低但仍保持較高水平，Ang-2mRNA于I/R 1d至高峰，此后Ang-2 mRNA表達(dá)逐漸降低，后又逐步增強(qiáng)的趨勢。Lin等〔16〕的研究表明，在大鼠局灶性腦梗死后，Ang-1 mRNA表達(dá)在再灌注1 w后才明顯增加，2 w后可達(dá)正常值的8倍;Ang-2 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)兩個(gè)峰值的變化，第一個(gè)高峰在腦梗死后24 h，此時(shí)Ang-2 mRNA表達(dá)是正常值的6.4倍，至72 h后開始下降但仍保持在底線水平;第二高峰在2周后出現(xiàn)，此時(shí)Ang-2 mRNA表達(dá)是正常值的4.6倍;Tie-2 mRNA則于再灌注24 h后開始升高且持續(xù)維持至2 w后。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Lin等〔16〕的研究似乎不甚一致可能由于時(shí)間點(diǎn)的選取、環(huán)境、取材，動(dòng)物品種及模型等不同所引起的，尚待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)面臨相同條件的腦缺血損傷后，老齡大鼠腦組織由于退行性改變，可能對缺血缺氧應(yīng)激反應(yīng)減弱，對Ang/Tie-2表達(dá)的調(diào)控能力明顯降低。結(jié)合上述研究結(jié)果，通過對蛋白與基因之間比較發(fā)現(xiàn)，隨著增齡，老齡大鼠Ang/Tie-2系統(tǒng)基因表達(dá)明顯減弱，這與因增齡變化而表現(xiàn)出的細(xì)胞因子表達(dá)下降的規(guī)律基本一致，由此可知，Ang/Tie-2系統(tǒng)基因的表達(dá)在一定程度上直接調(diào)控著其蛋白表達(dá)的多少。

綜合上述研究結(jié)果表明，腦I/R損傷后青、老齡大鼠在Ang/Tie-2系統(tǒng)的表達(dá)上均有明顯自身的特點(diǎn)，表現(xiàn)為青年大鼠達(dá)高峰后仍維持較高水平，而老齡大鼠Ang/Tie-2系統(tǒng)于I 3 h開始表達(dá)，I/R1d或I/R 3 d達(dá)高峰，峰值過后迅速下降，這與青年大鼠I/R后腦MVD和血管場面積的逐漸增加，老齡大鼠腦MVD和血管場面積持續(xù)降低的規(guī)律基本吻合。在腦缺血損傷初期老齡大鼠腦組織受到缺血缺氧刺激，使Ang/Tie-2系統(tǒng)的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而引起微血管代償性增殖，出現(xiàn)新的微血管再生，微血管數(shù)量相對增加，但隨著腦I/R時(shí)間的延長，老齡大鼠腦組織面臨缺血損傷較重，對缺血缺氧應(yīng)激反應(yīng)減弱，Ang/Tie-2系統(tǒng)表達(dá)逐漸降低，對微血管再生的調(diào)控能力也隨之減弱，微血管增值能力明顯降低故血管生成逐漸下降。總之，可以證實(shí)，腦I/R后腦微血管生成與Ang/Tie-2系統(tǒng)的表達(dá)密切相關(guān)，隨著腦I/R時(shí)間的延長，老齡大鼠微血管生成能力的逐漸降低，其機(jī)制可能與老齡大鼠腦I/R后Ang/Tie-2系統(tǒng)蛋白與基因的表達(dá)明顯減弱有關(guān)，提示增齡是影響老齡大鼠Ang/Tie-2系統(tǒng)的表達(dá)重要因素之一。

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