張麗杰，胡慶梅，邢志林，全學(xué)軍，趙天濤

(1.重慶理工大學(xué)，重慶 400054;

2.北京迪威爾石油天然氣技術(shù)開發(fā)有限公司，北京 100085)

三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)通常被企業(yè)用作金屬部件、電子部件的清洗溶劑和脫脂劑等，也可作為萃取溶劑、化工原料和織物干洗劑等。我國TCE的使用量很大，2010年TCE的表觀消費(fèi)量已達(dá)到15.07萬噸，并且在每年持續(xù)增加中［1］。TCE應(yīng)用廣泛，在水體、土壤和空氣中均能檢測到TCE［2－5］。大量研究表明:TCE 具有很強(qiáng)的環(huán)境毒性，對(duì)大鼠具有致癌作用，在長期暴露下對(duì)人體是有害的［6］。美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)在1976年就已將TCE列入“優(yōu)先控制化合物”和“疑似致癌物質(zhì)”［7］名單。我國常見污染地下水的有機(jī)物有25種，而TCE是最常見的鹵代物［8］。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者采用不同方法對(duì)TCE進(jìn)行處理［9－15］，主要包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)三方面。EPA已將空氣吹脫法和顆粒狀活性碳吸附法確定為治理被TCE污染的地下水和工業(yè)用水的最經(jīng)濟(jì)的方法。但是，這些方法不能永久地去除有毒污染物，而只是簡單地將污染物由一個(gè)介質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)介質(zhì)。生物修復(fù)能將有毒污染物轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)，與傳統(tǒng)的“抽出－處理”修復(fù)方法相比，地下水生物修復(fù)可以使清理成本降低50～75%，而與傳統(tǒng)的“挖出－焚燒”技術(shù)相比，土壤生物修復(fù)的花費(fèi)僅為其十分之一。因此，生物修復(fù)是一種具有廣闊應(yīng)用前景、經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好的修復(fù)技術(shù)。

微生物降解TCE的代謝機(jī)制是近20年的研究熱點(diǎn)［16－18］。好氧條件下，甲烷氧化菌、甲苯氧化菌和苯酚氧化菌等微生物可降解TCE。甲烷單加氧酶(MMO)可首先將TCE氧化為環(huán)氧化合物，然后在水中開環(huán)，生成二氯乙酸、醛基乙酸及一個(gè)碳原子的產(chǎn)物(CO、HCOOH)，再進(jìn)一步被氧化為CO2?？傮w而言，好氧代謝產(chǎn)物無毒性，且比厭氧還原脫氯的降解速率更快。

本文主要研究甲烷氧化菌群靜息細(xì)胞(沒有外來能源的條件下)對(duì)三氯乙烯(TCE)降解的影響，并推導(dǎo)共代謝降解TCE的動(dòng)力學(xué)模型［19］，以期通過動(dòng)力學(xué)參數(shù)的求取和分析在理論上深入理解甲烷氧化菌群降解三氯乙烯的能力及對(duì)三氯乙烯的親和力，為工程應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

NMS培養(yǎng)基的組成如下:KH2PO41.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9 g/L，MgSO4·7H2O 0.32 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，微量元素溶液10 mL，蒸餾水990 mL，pH=6.8。微量元素溶液組成如下:ZnSO4·7H2O 0.287 mg/L，MnSO4·7H2O 0.223 mg/L，H3BO30.062 mg/L，Na2MOO4·2H2O 0.048 mg/L，COCl2·6H2O 0.048 mg/L，KI 0.083 mg/L，CaCl2·2H2O 3.5 mg/L。

選取上海老港垃圾填埋場已填埋10年的礦化垃圾。取4 mm篩下和2 mm篩上垃圾顆粒約100 g，置于500 mL血清瓶后具塞密封，用甲烷氣體80 mL置換瓶中空氣，30℃密閉馴化2周實(shí)現(xiàn)甲烷氧化菌的復(fù)壯。

1.2 菌種活化及富集

稱取礦化垃圾1 g放入100 mL NMS培養(yǎng)基中，置于30℃、160 r/min搖床振蕩2 h。靜置1 h后得到菌懸液。取菌懸液2 mL作為種子接入分裝了20 mL NMS培養(yǎng)基的100 mL血清瓶中，用內(nèi)襯硅膠/聚四氟乙烯膠塞封口，外加鋁蓋密封。用20 mL甲烷氣置換瓶內(nèi)20 mL空氣，然后在30℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3～5 d。

將處于指數(shù)生長期的菌液轉(zhuǎn)移至10 mL的離心管中，使用低溫離心機(jī)進(jìn)行離心(溫度3～5℃，轉(zhuǎn)速3000 r/min，時(shí)間為5 min)。在無菌操作間倒掉離心管中上清液，加入滅過菌的NMS培養(yǎng)基清洗菌液，然后再進(jìn)行低溫離心，在無菌操作間中倒掉上清液。富集的甲烷氧化菌液中無甲烷，處于靜息狀態(tài)，備用。

1.3 分析測試

采用氣相色譜SC－6000A(配ECD檢測器)檢測三氯乙烯濃度。色譜柱:GDX－1 042 m;氮?dú)鉃檩d氣，載氣流速:35 mL/min;尾吹氣速:10 mL/min;進(jìn)樣器(汽化室)溫度:120℃;柱箱溫度(柱溫):80℃;檢測器溫度:200℃;進(jìn)樣量:0.1 mL;基流補(bǔ)償0.00 nA。

1.4 甲烷氧化菌群降解TCE的動(dòng)力學(xué)模型

所謂共代謝就是指原本不能被代謝的物質(zhì)在外界提供碳源和能源的情況下被代謝的現(xiàn)象。其中外界提供的能源稱為一級(jí)基質(zhì)，用于微生物細(xì)胞增長，并為微生物細(xì)胞活動(dòng)提供能量。被共代謝的物質(zhì)稱為二級(jí)基質(zhì)，不用于微生物細(xì)胞增長，也不能為微生物細(xì)胞活動(dòng)提供能量。

在模型推導(dǎo)過程中做如下假設(shè):將甲烷氧化菌群利用甲烷(一級(jí)基質(zhì))進(jìn)行增殖培養(yǎng)，至其指數(shù)期后利用靜息細(xì)胞降解鹵代烴;鹵代烴是二級(jí)基質(zhì)，既不能作為碳源也不能作為能源。在降解過程中，菌體濃度基本保持不變，即CX為一常數(shù)?；谝陨霞僭O(shè)，單底物酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特性往往服從Michael-Mentonno模型，可用于描述TCE的代謝，即:

式(1)中:rs為 TCE 的降解速率(mg/min);qs，max為TCE最大比消耗速率，即單位時(shí)間內(nèi)單位質(zhì)量菌體降解TCE的質(zhì)量(min－1);KS為半飽和常數(shù)，其值大小表征細(xì)胞與底物的親和作用(mg/L);CX為菌體濃度(mg/L);CS為TCE濃度(g/L)

用L－B雙倒數(shù)法可求取qs，max和Ks。對(duì)于分批操作采用time-step法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具體如下:式(1)兩邊同時(shí)除CX并取倒數(shù)得:

根據(jù)提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在很短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間間隔內(nèi)，式(2)中rs可近似表示為

Cs取Δt范圍內(nèi)的平均值，即，X基本上不變，為常數(shù)，則式(2)為:

2 結(jié)果及討論

2.1 菌體干重與菌液吸光度的線性擬合

將裝有100 mL MS液體培養(yǎng)基的血清瓶加入5 mL混合菌液，抽取100 mL空氣，再充入100 mL甲烷，進(jìn)行恒溫震蕩培養(yǎng)(30℃、160 r/min)。培養(yǎng)一天后抽取菌液在600 nm波長下測吸光度，間隔30 min。同時(shí)將5 mL菌液放入培養(yǎng)皿烘干至恒重，得到干重質(zhì)量。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2～3次，確保平均誤差小于5%。由圖1可知:混合菌濃度CX吸光度OD600nm線性關(guān)系很好，可決系數(shù)達(dá)到了0.993 1。線性方程為 y=2.934x+0.0436，式中 x是菌液吸光度OD600nm，y是菌體濃度CX，單位為g/L。經(jīng)過活化和富集的混合菌液OD600nm=0.574±0.001。由圖1可知富集后的混合菌液濃度為1.728 g/L。

圖1 混合菌液吸光度與菌體濃度擬合

2.2 甲烷氧化菌群對(duì)TCE的降解效果

將10 mL TCE加入120 mL滅菌的去離子水中，再加入玻璃珠振蕩，靜止10 min后，抽取飽和TCE溶液。取裝有100 mL菌液的血清瓶加入上述飽和TCE溶液1 mL，25℃下放置4 h，使TCE達(dá)到氣液平衡。然后加入10 mL菌液(CX=1.728 g/L)，頂空取樣后利用氣相色譜ECD檢測TCE的濃度變化，由亨利定律可換算得到TCE的液相濃度［20］。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2～3次，確保平均誤差小于5%，對(duì)照組不加入菌液。TCE隨時(shí)間變化的降解曲線如圖2所示。。

圖2 TCE隨時(shí)間變化的降解曲線

由圖2可見:甲烷氧化菌群的靜息細(xì)胞在6 h內(nèi)將初始濃度為45.5 mg/L的 TCE降解至9.5 mg/L，降解總量達(dá)到了3.6 mg，降解率達(dá)到79%。

2.3 甲烷氧化菌群降解TCE的動(dòng)力學(xué)推導(dǎo)

根據(jù)時(shí)間步長法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)模型方程，在實(shí)驗(yàn)中得到如表1所示的數(shù)據(jù)。表中:Csg表示血清瓶中氣相TCE的濃度，單位為mg/L;CsL表示血清瓶中液相TCE的濃度，單位為mg/L，根據(jù)25℃亨利系數(shù) H 為1.04×10－3(MPa·m3/mol)換算得到［20］;ΔCsL表示在測量間隔內(nèi)兩次 TCE的濃度差，單位為mg/L;表示在測量間隔內(nèi)底物TCE的平均降解速率，單位為mg/(L·min);Δt為測量時(shí)間間隔，單位為min;表示測量時(shí)間間隔內(nèi)底物TCE的平均濃度，單位為mg/L。

表1 甲烷氧化菌群菌降解TCE動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)

根據(jù)圖3可看出CX/rs－1/CS的線性關(guān)系良好，可決系數(shù) R2=0.961，說明 TCE降解符合Monod方程。由方程的截距和斜率，再根據(jù)圖3可以求出 qs，max=1.51 ×10－4min－1，KS=2.58 mg/L，其降解動(dòng)力學(xué)方程為:對(duì)于前期報(bào)道的甲烷氧化菌OB3b，當(dāng)TCE初始濃度為0.66～32.9 mg/L時(shí)，半飽和常數(shù) KS為 19.1 mg/L［21］;初始濃度為0.06 ～8.0 mg/L 時(shí)，半飽和常數(shù) KS為 10.8 mg/L［22］。通過比較可知，本實(shí)驗(yàn)所用的甲烷氧化菌群的半飽和常數(shù)KS是1.5 mg/L(TCE初始濃度為45.5 mg/L)，明顯小于OB3b菌，說明該甲烷氧化菌菌群對(duì)TCE有更強(qiáng)的親和力，且轉(zhuǎn)化總量高，可達(dá)到 3.6 mg，而 Lisa［16］報(bào)道的甲烷氧化菌群最大轉(zhuǎn)化總量僅為0.4 mg/瓶。

圖3 氯代烴降解動(dòng)力學(xué)擬合

3 結(jié)束語

在甲烷、甲醇、乙醇、苯酚等碳源和能源同時(shí)存在的情況下，甲烷氧化菌可以利用甲烷單加氧酶共代謝降解氯代烴，這對(duì)被氯化物污染過的土壤、地下水或空氣來說具有重要意義。共代謝動(dòng)力學(xué)很復(fù)雜，且受到底物、產(chǎn)物的數(shù)量和濃度以及它們之間的抑制競爭關(guān)系等因素影響。在共代謝過程中會(huì)不可避免地發(fā)生副反應(yīng)，產(chǎn)生對(duì)微生物有害的物質(zhì)，從而降低氯化物的降解速率。探討共代謝過程中影響降解速率的動(dòng)力學(xué)參數(shù)因素，研究其動(dòng)力學(xué)規(guī)律對(duì)修復(fù)被氯化物污染的工業(yè)產(chǎn)物具有重要的意義。

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