施潔 唐曦 葛偉 侯立皓 婁青林 歐陽鋼

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后婦女的常見病和多發(fā)病，因骨丟失所造成的病理性骨折的增加，嚴(yán)重?fù)p害著老年婦女的健康。目前對(duì)骨質(zhì)疏松的防治研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的重要課題。近年來，針灸治療骨質(zhì)疏松在臨床上取得了良好的療效，可明顯改善骨質(zhì)疏松患者的臨床癥狀，提高患者骨密度，延緩骨量的丟失［1-2］，但有關(guān)針灸防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)以切除大鼠卵巢制作絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，觀察電針對(duì)去卵巢大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響，以探討針灸抗骨質(zhì)疏松的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選取60 只3 月齡SD 雌性清潔性大鼠，體質(zhì)量180 ～200 g。未曾交配，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為:SCXK(滬)2007-0005。動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成A、B 2 組，其中A 組為假手術(shù)組，共20 只，不切除雙側(cè)卵巢;B 組為模型組，共40 只，切除雙側(cè)卵巢，手術(shù)操作同A 組。3 月后2 組各取10 只大鼠進(jìn)行骨密度檢測(cè)確定造模是否成功［3］。造模成功后處死，提取骨標(biāo)本保存。將A 組余下的10 只大鼠設(shè)為假手術(shù)組;B 組余下的30 只大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組和雌激素組，每組各10 只。

1.2 動(dòng)物造模制作 用3%戊巴比妥鈉(按0.1 ml/100 g)經(jīng)大鼠腹腔注射麻醉后，于背部正中切口進(jìn)入腹腔背側(cè)，完整摘除雙側(cè)卵巢后，仔細(xì)止血，逐層縫合。假手術(shù)組取腰椎旁背側(cè)切口，進(jìn)入腹腔，切除一段小腸系膜后，立即止血縫合。動(dòng)物手術(shù)后給予抗生素3 d，防止感染，自由攝食，飲水。

1.3 治療方法

1.3.1 針刺組:大鼠不作麻醉，在自己設(shè)計(jì)的鼠架上進(jìn)行針灸操作。選穴:(1)關(guān)元、三陰交(雙側(cè));(2)腎俞、后三里(雙側(cè))，每日選取其中1 組穴位，2 組穴位交替進(jìn)行，取穴方法按華興邦氏的方法實(shí)施，用細(xì)美容針刺入穴位后，接韓氏電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行電針刺激，其刺激參數(shù)為:連續(xù)脈沖波、頻率3 ～4 Hz、強(qiáng)度4 ～5 mA，以動(dòng)物局部輕度抖動(dòng)為度，每次20 min，每日1 次，連續(xù)治療3 月。

1.3.2 雌激素組:造模成功后，按人鼠劑量換算，每只大鼠以0.1 mg/kg，皮下注射苯甲酸雌二醇，每周1 次，連續(xù)3 月。

1.3.3 假手術(shù)組與模型組:不作任何處理。

1.4 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察

1.4.1 四環(huán)素活體標(biāo)記與不脫鈣切片制作［4-5］:大鼠處死前14 d 腹腔內(nèi)注射1%四環(huán)素生理鹽水30 mg/kg，處死前4 d 腹腔內(nèi)注射1% 鈣黃綠素5 mg/kg，進(jìn)行活體熒光標(biāo)記。3 月后，用10 g/L 的戊巴比妥鈉麻醉并斷頭處死大鼠，取其左側(cè)股骨下段干骺端長(zhǎng)約1 cm 骨組織，置于4 ℃70%乙醇中固定，再經(jīng)梯度酒精、丙酮脫水、脫脂，將標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后浸透包埋于甲基丙烯甲酯、丁酯及過氧化苯乙酰的聚合物中，置于4 ℃冰箱中聚合，用Jung K 型重型切骨機(jī)切成8 μm 的厚骨片(用于測(cè)量松質(zhì)骨動(dòng)態(tài)參數(shù))和4 μm 的薄骨片(用于測(cè)量松質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù))。薄片行von Kossa 及Giemsa 染色封片，厚片不染色作熒光觀察。

1.4.2 骨組織觀察及測(cè)量參數(shù):采用半自動(dòng)數(shù)字化圖像分析系統(tǒng)和測(cè)量軟件(OsteoMeasure;OsteoMetrics，Inc，USA)在距骺線1 mm 處至遠(yuǎn)端3 mm 范圍內(nèi)進(jìn)行松質(zhì)骨的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測(cè)量。測(cè)量的指標(biāo)有:靜態(tài)參數(shù):(1)骨小梁面積分?jǐn)?shù)(Tb. Ar);(2)骨小梁數(shù)(Tb.N);(3)骨小梁寬度(Tb.Wi);(4)骨小梁分離度(Tb.Sp)。動(dòng)態(tài)參數(shù):(1)熒光周長(zhǎng)百分率(L. Pm);(2)礦化沉積率(MAR);(3)礦化延遲時(shí)間(MLT);(4)類骨質(zhì)周長(zhǎng)百分率(O.Pm);(5)骨吸收周長(zhǎng)百分率(Er.Pm);(6)骨形成率(BFR/BS)各參數(shù)意義及相關(guān)計(jì)算公式見文獻(xiàn)［6］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 11.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以±s 表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK 法，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)去卵巢大鼠骨形態(tài)靜態(tài)參數(shù)的影響 切除大鼠雙側(cè)卵巢后，模型組Tb.Ar，Tb.N 及Tb.Wi 均顯著減少，Tb.Sp 明顯增加，與假手術(shù)組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。提示模型組大鼠在去勢(shì)后骨量顯著下降，骨小梁間結(jié)構(gòu)破壞，骨質(zhì)疏松形成。見表1。經(jīng)3 月連續(xù)治療后，與模型組相比，電針組和雌激素組Tb. Ar，Tb. Wi 的水平均有不同程度的提高，而Tb.Sp 均有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，且在雌激素組中Tb. N 與模型組相比亦有顯著增加(P ＜0.05)。電針組中Tb.Ar，Tb.Wi 顯著低于雌激素組，而Tb.Sp 則明顯高于雌激素組，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)指標(biāo)(±s，n=10)

表1 各組骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)指標(biāo)(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與雌激素組比較，▲P ＜0.05

組別Tb.Ar(%)Tb.Wi(μm)Tb.N(個(gè)/μm)Tb.Sp(μm)假手術(shù)組37.43 ±5.8782.54 ±9.734.11 ±0.43218.80 ±151.89模型組20.66 ±4.54＊＊56.07 ±10.2＊＊1.07 ±0.56＊＊592.63 ±166.02＊＊雌激素組27.19 ±4.01＊＊△△77.13 ±9.43△1.98 ±0.73＊＊△228.58 ±113.44＊＊△△電針組25.39 ±2.82＊＊△▲67.13 ±6.48＊＊1.61 ±0.59＊＊411.80 ±144.48＊＊△▲

2.2 電針對(duì)去卵巢大鼠骨形態(tài)動(dòng)態(tài)參數(shù)的影響 切除大鼠雙側(cè)卵巢后，與假手術(shù)組相比，模型組L. Pm、MAR、O. Pm 及Er. PM、BFR/BS 均顯著增加(P ＜0.05，P ＜0.01)，MLT 明顯縮短(P ＜0.05)。表明模型組大鼠去勢(shì)后，新骨形成和礦化的速率加快，骨轉(zhuǎn)化活躍，骨形成與骨吸收都增強(qiáng)，呈現(xiàn)高代謝狀態(tài)。

經(jīng)3 月連續(xù)治療后，電針組L.Pm、MAR 均有明顯升高，Er.PM、MLT 下降明顯，與模型組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05 或P ＜0.01)，而O.Pm 和BFR/BS 較模型組而言，變化不明顯;雌激素組中，與模型組相比，L.Pm、MAR均有所下降(P ＜0.01)，Er.PM、BFR/BS 也明顯減少(P ＜0.01)，而O.Pm、MLT 則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。電針組中L.Pm、MLT、BFR/BS 較雌激素組明顯升高，而MLT 則顯著下降(P ＜0.01)。見表2。

表2 各組骨形態(tài)計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)指標(biāo)(±s，n=10)

表2 各組骨形態(tài)計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)指標(biāo)(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05 ，△△P ＜0.01;與雌激素組比較，▲▲P ＜0.01

項(xiàng)目L.Pm(%)O.Pm(%)Er.PM(%)10.31 ±5.6220.46 ±3.1211.53 ±3.12模型組16.69 ±6.32*28.11 ±4.33*17.62 ±4.18＊＊雌激素組7.81 ±4.29△△24.34 ±5.5712.97 ±4.23△△電針組25.15 ±6.71＊＊△▲▲26.78 ±3.34＊＊14.84 ±3.56假手術(shù)組＊△項(xiàng)目MAR(μm/d)MLT(d)BFR/BS(%)0.98 ±0.137.07 ±0.979.16 ±2.23模型組1.13 ±0.11*6.13 ±0.54*16.07 ±3.25＊＊雌激素組0.76 ±0.16＊＊6.52 ±0.8110.71 ±1.97電針組1.36 ±0.23＊＊△△▲▲4.16 ±0.76＊＊△△▲▲18.97 ±3.13假手術(shù)組＊＊△△▲▲

2. 3 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 假手術(shù)組骨小梁較粗，排列密集而整齊，連續(xù)性好(圖1)。模型組去勢(shì)后骨小梁排列稀疏，骨小梁間連接差，出現(xiàn)大量骨小梁盲端(圖2)。經(jīng)電針治療后，骨小梁密度增大，骨小梁數(shù)目增加，但仍不如正常結(jié)構(gòu)，小梁間連接性差(圖3)。經(jīng)雌激素治療后，骨小梁數(shù)目增加，小梁間連接增多，排列有序，仍未達(dá)正常結(jié)構(gòu)(圖4)。

3 討論

骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是利用體視學(xué)原理，將形態(tài)學(xué)觀察到的骨組織結(jié)構(gòu)改變用定性、定量的計(jì)量方法進(jìn)行計(jì)算［7］。不僅能夠精確地測(cè)量骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)和骨組織形態(tài)學(xué)及總體骨量的變化，而且能夠通過“四環(huán)素標(biāo)記”的骨計(jì)量學(xué)技術(shù)將時(shí)間因素標(biāo)記在骨形成期的礦化過程，能動(dòng)態(tài)觀察到完整的激活-吸收-形成-靜止過程的改變，了解其產(chǎn)生結(jié)構(gòu)差異的根本原因與代謝的信息狀況［8］。因此在疾病的發(fā)生機(jī)制研究、藥物療效的評(píng)價(jià)中都有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值［9］。將骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)運(yùn)用于針刺研究中，不僅能從靜態(tài)參數(shù)中對(duì)骨組織水平的質(zhì)(骨結(jié)構(gòu))和量(骨量)進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，而且可以通過測(cè)量其動(dòng)態(tài)參數(shù)，了解骨組織形態(tài)細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)特性，因此，骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)對(duì)客觀評(píng)價(jià)針灸治療骨質(zhì)疏松癥的效果，進(jìn)一步闡明針灸抗骨質(zhì)疏松癥的可能作用機(jī)制均提供了一個(gè)很好的研究手段。

本次實(shí)驗(yàn)采用摘除大鼠雙側(cè)卵巢的方法復(fù)制骨質(zhì)疏松模型，因其骨量丟失與絕經(jīng)后婦女相似，國(guó)內(nèi)外報(bào)道均認(rèn)為是比較合適的［10-11］。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組與假手術(shù)組相比，其骨量明顯下降，骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。從動(dòng)態(tài)參數(shù)分析，骨吸收活動(dòng)增強(qiáng)，破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)，同時(shí)機(jī)體通過破骨-成骨偶聯(lián)作用，使成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，數(shù)量明顯增多，分泌類骨質(zhì)功能增強(qiáng)。這些變化顯示模型組大鼠去卵巢后呈現(xiàn)較高的骨轉(zhuǎn)換率，骨吸收和骨形成均增強(qiáng)，但骨吸收大于骨形成，致大鼠股骨骨量下降，骨結(jié)構(gòu)稀疏，骨質(zhì)疏松形成，造模成功。

中醫(yī)認(rèn)為腎主骨生髓，脾主四肢肌肉，為氣血生化之源，脾腎兩臟與骨質(zhì)疏松關(guān)系密切，故以補(bǔ)腎健脾為治療原則，選取腎俞、后三里、關(guān)元、三陰交等穴［12］。經(jīng)電針治療后，從動(dòng)態(tài)參數(shù)上看，與模型組比較，L.Pm 增加顯著，說明電針能夠刺激成骨細(xì)胞的生成，加速骨的形成。MAR 增加，MLT 減少表明電針能使成骨細(xì)胞活性增加，礦化功能增強(qiáng)，BFR/BS 與模型組相比雖然其差異無顯著性，但亦有一定程度的提高，表明骨形成增加。在骨吸收方面，Er.Pm 比模型組明顯減少，表明破骨細(xì)胞功能受到一定抑制，其活性減低，致使骨吸收下降。從靜態(tài)參數(shù)上看，與模型組比較，電針組Tb.Wi 明顯提高，Tb.Sp 顯著減小，Tb.N 與模型組相比雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但整體也有增加的趨勢(shì)，表明骨小梁間形態(tài)結(jié)構(gòu)得到改善，Tb.Ar 較模型組也有明顯增加，骨量得到維持。由上述分析可知，電針能夠增加成骨細(xì)胞數(shù)目和活性，促進(jìn)骨形成，并且對(duì)破骨細(xì)胞起到一定抑制作用，使骨吸收減弱，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的。

雌激素是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥確切有效的藥物［13］，本次實(shí)驗(yàn)采用雌激素作為對(duì)照，旨在比較針刺與藥物在治療骨質(zhì)疏松癥療效及作用機(jī)制上的差異。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往報(bào)道的相同［13］，雌激素對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療作用是通過降低高骨轉(zhuǎn)換率，即同時(shí)減緩骨吸收和骨形成(以抑制骨吸收為主)，從而糾正骨代謝負(fù)平衡，達(dá)到減少骨量丟失，改善骨結(jié)構(gòu)的目的。

綜上所述，電針能明顯改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)，通過抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成，使骨形成大于骨吸收而呈正平衡狀態(tài)，從而使骨量和骨結(jié)構(gòu)明顯改善，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的。

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