范雪平 牛 兵 王倩倩 張 勇

1.河南省口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南 鄭州 450052；2.河南省中醫(yī)院口腔科，河南 鄭州 450003；3.鄭州人民醫(yī)院口腔科，河南 鄭州 450003；4.河南省駐馬店市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，河南 駐馬店 463000

變形鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是公認(rèn)的口腔主要致齲菌[1]，具有高度黏附于牙面的能力，變鏈菌在牙面上黏附和定植是變鏈菌致齲的始動(dòng)因子[2]其黏附過程經(jīng)歷兩個(gè)階段后形成菌斑生物膜。第一階段變鏈菌表面蛋白與獲得性膜中宿主因子之間相互作用形成初始黏附，即非蔗糖依賴性黏附。第二階段變鏈菌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glueosyltransferase，GTFs）利用蔗糖合成水不溶性葡聚糖來(lái)介導(dǎo)該菌的蔗糖依賴性黏附、集聚。變鏈菌通過黏附定居于牙面，形成致齲性微生態(tài)環(huán)境牙菌斑，利用糖產(chǎn)酸，導(dǎo)致牙齒脫礦，產(chǎn)生齲病[3]。細(xì)菌表面疏水性（cell surface hydrophobicity，CSH）是細(xì)菌非特異性黏附的重要部分，研究表明，細(xì)菌表面疏水性在細(xì)菌對(duì)牙面及口腔上皮細(xì)胞的初始黏附中起著重要作用，表面疏水性越強(qiáng)的細(xì)菌黏附力越強(qiáng)[4]。目前尋找安全有效的防齲物質(zhì)是齲病防治研究的重點(diǎn)。羧甲基殼聚糖對(duì)諸多口腔細(xì)菌均有一定的抑制作用[5]，并具有良好的生物相容性和可降解性，可形成凝膠或膜狀結(jié)構(gòu)，尤其適用于口腔。目前對(duì)其在防齲方面的研究主要集中在抑菌方面，而對(duì)其防齲機(jī)制的研究報(bào)道較少。

本研究采用微生物黏著碳?xì)浠衔锓ǎ╩icrobial adhesion to hydrocarbons，MATH）[6]， 測(cè)定不同濃度的羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌表面疏水性的影響及在玻壁表面的黏附作用，探討其影響變形鏈球菌黏附的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3種羧甲基殼聚糖，平均相對(duì)分子質(zhì)量（MW）分別為5500、10000、12000，脫乙酰度（D.D）均為 90.6%，由青島海匯生物工程有限公司提供；TPY培養(yǎng)基，由北京陸橋技術(shù)有限公司提供。十六烷（沃凱），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 （上海）。BHI培養(yǎng)基：OXOID LTD，Basingstoke，Hampshire，England。實(shí)驗(yàn)菌株變形鏈球菌 Streptococcus mutans，S.mutans ATCC 25175，菌株由四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液調(diào)整 將變形鏈球菌ATCC25175凍干菌株復(fù)蘇并接種于 BHI固體培養(yǎng)基中，在 37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）厭氧培養(yǎng)48 h，經(jīng)鑒定后，轉(zhuǎn)移到含2%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基中，于 37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）條件下厭氧箱培養(yǎng)24 h。以2500 r/min離心15 min（離心半徑13.5 cm），收集細(xì)菌，PUM緩沖液洗菌3次，每次3 mL。用PUM緩沖液作為空白對(duì)照，將紫外可見分光光度計(jì)調(diào)零，用PUM緩沖液調(diào)在660 nm波長(zhǎng)處吸光度A=0.5的菌懸液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。空白對(duì)照組的菌體用PUM緩沖液處理（不含羧甲基殼聚糖溶液）3 mL；實(shí)驗(yàn)組分別為含不同分子質(zhì)量不同濃度的羧甲基殼聚糖的 BHI培養(yǎng)基 3 mL， 濃度分別為：5，2.5，1.25，0.64，0.32，0.16 g/L，共7組。以上實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每組4個(gè)平行管，共計(jì)84管。

1.2.3 疏水性測(cè)定 采用微生物黏著碳?xì)浠衔颷6]（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）測(cè)定不同濃度的羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌表面疏水性的影響。調(diào)整菌懸液的吸光度A=0.5取3 mL加入羧甲基殼聚糖溶液的試管中，混和均勻，再將其放置在水浴箱中，調(diào)整水浴箱的溫度為37℃孵育15 min，取 3 mL，加入400 μL十六烷，劇烈震蕩60 s，使各個(gè)試管充分混和均勻。然后再靜置15 min，使試管中的羧甲基殼聚糖溶液分為上下兩層，其上層為油層，下層是水層，取油層進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌；保留水層，用紫外可見分光光度計(jì)在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)試管的吸光度A值，每管分別測(cè)3次，記錄平均值。細(xì)菌表面疏水率=（初始 A660nm－加十六烷后 A660nm）/初始 A660nm×100%。

1.2.4 黏附作用的測(cè)定 采用Hattori等[2-7]的研究方法測(cè)定其對(duì)變形鏈球菌的黏附抑制作用。取84個(gè)10 mL玻璃試管，設(shè)每組4個(gè)平行管，分別加入以上備好的菌液0.1 mL，BHI液體培養(yǎng)基2.1 mL和50%蔗糖-0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液0.25 mL，再分別向各個(gè)試管中加入實(shí)驗(yàn)組（分別為含不同分子量不同濃度的羧甲基殼聚糖的BHI培養(yǎng)基3 mL）和對(duì)照組（不含羧甲基殼聚糖溶液）溶液0.05 mL，混和均勻，將各個(gè)試管與水平面斜行呈300°角放置，37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）的條件下放置于厭氧箱中培養(yǎng)18 h。然后輕輕移去試管中的溶液，將黏附到試管壁的細(xì)菌用蒸餾水洗脫，每次3 mL，共計(jì)3次，然后以3500 r/min離心15 min（離心半徑13.5 cm），收集細(xì)菌，再將其置于3 mL蒸餾水中，混勻。用波長(zhǎng)為550 nm的紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定A550nm，計(jì)算黏附抑制率。羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌的黏附抑制的影響使用黏附抑制率表示。黏附抑制率=（對(duì)照組A550nm－實(shí)驗(yàn)組 A550nm）/對(duì)照組 A550nm×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，各樣本組間均數(shù)之間的比較采用SNK檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌ATCC 25175表面疏水性的影響

結(jié)果見表1，不同分子質(zhì)量羧甲基殼聚糖隨著其濃度的增加其疏水率逐漸降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：同一分子質(zhì)量，濃度不同各組羧甲基殼聚糖與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間兩兩比較結(jié)果顯示：分子量為5500的羧甲基殼聚糖濃度為1.25、2.5、5.0 g/L組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.64、0.32、0.16 g/L 時(shí)，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；分子量為10000的羧甲基殼聚糖濃度為 0.64、1.25、2.5、5.0 g/L 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05）；0.32 g/L與0.16 g/L時(shí)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；分子量為12000的羧甲基殼聚糖，5 g/L與2.5 g/L，0.64 g/L、0.32 g/L、0.16 g/L之間組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

表1 不同分子質(zhì)量、濃度羧甲基殼聚糖培養(yǎng)后變鏈菌表面疏水率的比較（100%，n=4，）

表1 不同分子質(zhì)量、濃度羧甲基殼聚糖培養(yǎng)后變鏈菌表面疏水率的比較（100%，n=4，）

分組 稀釋度（g/L）分子質(zhì)量5500 10000 12000實(shí)驗(yàn)組5空白組F值P值2.51.250.640.320.1600.096±0.0140.113±0.0200.152±0.0230.247±0.0120.268±0.0150.293±0.0100.535±0.016280.8160.0000.099±0.0140.117±0.0160.154±0.0130.250±0.0150.274±0.0150.288±0.0180.535±0.016380.7740.0000.116±0.0150.136±0.0240.172±0.0200.260±0.0230.281±0.0200.301±0.0190.535±0.016189.0630.000

2.2 羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌培養(yǎng)后菌液吸光度值的影響

結(jié)果見表2，隨著羧甲基殼聚糖溶液濃度的升高，其黏附吸光度值逐漸降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，分子質(zhì)量相同，濃度不同的各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間兩兩比較結(jié)果顯示：當(dāng)分子量為5500及10000時(shí)，0.32 g/L與0.16g/L兩濃度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；當(dāng)分子量為 12000時(shí)，0.64、0.32、0.16 g/L 濃度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 不同分子質(zhì)量、濃度羧甲基殼聚糖培養(yǎng)后對(duì)變形鏈球菌菌液吸光度值的影響（n=4，）

表2 不同分子質(zhì)量、濃度羧甲基殼聚糖培養(yǎng)后對(duì)變形鏈球菌菌液吸光度值的影響（n=4，）

分組 濃度（g/L）分子量5500 10000 12000實(shí)驗(yàn)組5空白組F值P值2.51.250.640.320.1600.097±0.0110.135±0.0090.169±0.0060.191±0.0100.212±0.0080.222±0.0050.255±0.005173.1860.0000.103±0.0060.144±0.0060.174±0.0070.199±0.0070.218±0.0070.223±0.0070.255±0.005266.4510.0000.147±0.0050.175±0.0050.200±0.0050.217±0.0060.225±0.0070.228±0.0070.255±0.005163.9050.000

2.3 羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌黏附抑制的影響

結(jié)果見表3，不同分子質(zhì)量羧甲基殼聚糖隨著其濃度的增加其黏附抑制率也隨之降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分子質(zhì)量相同，濃度不同的各組黏附抑制值總體均數(shù)間具有顯著性差異（P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示：分子質(zhì)量為5500及10000時(shí)，0.32 g/L與0.16 g/L兩個(gè)濃度組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分子量為12000時(shí)，0.64 g/L、0.32 g/L與0.16 g/L濃度組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其他各濃度組間黏附抑制值均有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 不同分子質(zhì)量、濃度羧甲基殼聚糖對(duì)變鏈菌黏附抑制率的影響（100%，n=4，）

表3 不同分子質(zhì)量、濃度羧甲基殼聚糖對(duì)變鏈菌黏附抑制率的影響（100%，n=4，）

稀釋度（g/L） 分子質(zhì)量5500 10000 1200052.51.250.640.320.16 F值P值0.620±0.0440.463±0.0250.337±0.0240.250±0.0410.169±0.0330.128±0.021132.1210.0000.596±0.0230.437±0.0240.330±0.0260.231±0.0340.146±0.0250.125±0.027184.6580.0000.425±0.0180.313±0.0200.216±0.0210.148±0.0220.119±0.0260.107±0.027163.9050.000

3 討論

3.1 殼聚糖/羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌的疏水性作用的影響

目前研究認(rèn)為，蔗糖非依賴性黏附主要是通過疏水作用、鈣橋靜電、氫鍵等非特異性黏附和細(xì)菌表面粘結(jié)素與獲得性膜受體之間的特異性黏附。疏水性是指非極性溶液在極性水中所呈現(xiàn)的一種不穩(wěn)定狀態(tài)，并由此引發(fā)的一系列熱能和分子重新分布及排列的變化[8]。CSH被認(rèn)為是影響細(xì)菌一宿主反應(yīng)的因素之一，其強(qiáng)弱與蔗糖非依賴性黏附密切相關(guān)[9]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，疏水性的強(qiáng)弱與細(xì)菌表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸、莢膜等結(jié)構(gòu)有關(guān)。細(xì)菌表面的疏水蛋白與獲得性膜中的疏水基團(tuán)結(jié)合，表面疏水蛋白愈多其疏水性愈強(qiáng)，細(xì)菌黏附力也愈強(qiáng)[10]。

MATH是根據(jù)細(xì)菌在各種碳?xì)浠衔镏薪?jīng)過簡(jiǎn)短期的混合，下層水相吸收能力減少，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳?xì)浠衔镳じ降某潭炔煌?，通過測(cè)定水相的吸光度，可確定細(xì)菌表面疏水性的大小[11]。本實(shí)驗(yàn)即采用該方法研究羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌疏水性的影響。結(jié)果表明：不同分子量的羧甲基殼聚糖溶液，濃度為0.16 g/L時(shí)作用于變形鏈球菌細(xì)胞表面，其表面疏水性明顯降低，與空白對(duì)照組之間有顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)表明：濃度為0.16 g/L羧甲基殼聚糖溶液可以通過表面疏水性明顯降低來(lái)抑制變形鏈球菌的黏附作用。它的作用機(jī)制是疏水作用、鈣橋靜電、氫鍵等非特異性黏附和細(xì)菌表面粘結(jié)素與獲得性膜受體之間的特異性黏附，還是通過其他方式，需要進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制的研究。

3.2 殼聚糖/羧甲基殼聚糖對(duì)變形鏈球菌的黏附作用的影響

黏附在牙齒齲病發(fā)生中起重要作用，而變形鏈球菌對(duì)牙面有高度的黏附作用。殼聚糖及其衍生物對(duì)變形鏈球菌黏附抑制作用已有少量報(bào)道。

Tarsi等[12]報(bào)道低分子量殼聚糖能選擇性阻止變形鏈球菌在羥基磷灰石表面的黏附及促進(jìn)已黏附的變形鏈球菌的解脫。Virga等[13]研究證實(shí)，高分子殼聚糖當(dāng)濃度為0.5%時(shí)即可對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)生特異性的解脫黏附作用。有研究指出[10]，殼聚糖可抑制變形鏈球菌對(duì)毛細(xì)管的黏附，并促進(jìn)附著于黏附板上的變形鏈球菌脫落，0.5%濃度的殼聚糖作用強(qiáng)于0.25%。

本研究與上述報(bào)道相似，結(jié)果表明，不同分子量的羧甲基殼聚糖可降低變形鏈球菌表面的疏水性，并抑制變形鏈球菌在光滑玻壁表面的黏附能力；當(dāng)濃度為0.16 g/L時(shí)作用于變形鏈球菌培養(yǎng)后，其菌液吸光度值與對(duì)照組相比具有顯著性差異。羧甲基殼聚糖能夠有效降低口腔內(nèi)變形鏈球菌的黏附，從而減少其在菌斑中的數(shù)量，在臨床上可以通過羧甲基殼聚糖的這一特性達(dá)到防治齲病的目的。但其作用機(jī)制復(fù)雜，是否存在對(duì)黏附作用抑制的另外機(jī)制，既蔗糖依賴性黏附有抑制作用，還需要進(jìn)一步深入研究。

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