劉少靜，楊黎彬，王小寧，吳艷茹

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

冬蟲夏草(Cordyceps)系麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis Berk.Sacc.寄生于鱗翅目蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆蟲幼蟲上所形成的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，主要分布在我國青海、西藏、四川、云南等地海拔3000～5100 m的高寒草甸區(qū)。由于自然條件的限制和近年來的過度采挖，天然蟲草資源已日益匱乏，現(xiàn)多用人工蟲草來滿足市場的需求[1－2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冬蟲夏草具有廣泛藥理活性，如調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)活性、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腎功能、恢復(fù)肝功能、抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病等，且毒副作用小[3－4]。目前冬蟲夏草所含核苷類物質(zhì)如腺嘌呤、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺苷、蟲草素等已成為研究的焦點。文獻報道測定冬蟲夏草中核苷類物質(zhì)含量的方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和毛細管電泳法(CE)等[5－6]。本研究中建立了定量分析冬蟲夏草中尿苷和腺嘌呤的有效方法，旨在為進一步開展冬蟲夏草的品質(zhì)評價及相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Dionex P680A型高效液相色譜儀(美國戴安公司);FA1004B型電子天平(精度為0.1 mg，上海越平科學(xué)儀器有限公司);KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);L－550臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。尿苷對照品(批號為 887－200001，純度為 98%);腺嘌呤對照品(批號為140662－200301，純度為98%)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。蟲草菌粉(煙臺瑞東科技發(fā)展有限公司，批號為 20091218，20100407，20100511)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Kromasil C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－水溶液(5∶95);檢測波長:260 nm;柱溫:25℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL。在此條件下，色譜圖見圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

分別精密稱取尿苷和腺嘌呤對照品適量，用超純水溶解并定容，得尿苷和腺嘌呤質(zhì)量濃度均為1000 μg/mL的混合對照品母液。精密吸取一定量母液，加超純水定容配制成尿苷和腺嘌呤質(zhì)量濃度均為 500，250，125，50，25，5 μg/mL 的系列混合對照品溶液，4℃冷藏備用。精密稱取過40目篩的冬蟲夏草粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加水適量，稱重，室溫下超聲提取30 min，取出放冷，再稱定質(zhì)量，用水補充丟失的質(zhì)量，4000 r/min離心5 min，取上清液過膜，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取系列混合對照品溶液各10 μL，按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以進樣質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸，尿苷和腺嘌呤的線性回歸方程分別為 Y=0.3472 X+0.7907(r=0.9993)，Y=1.0171 X+4.701(r=0.9991)。結(jié)果表明，二者質(zhì)量濃度均在5～500 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密吸取 50 μg/mL對照品溶液 10 μL，按照2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣5次。結(jié)果尿苷和腺嘌呤峰面積的RSD分別為0.46%和0.19%(n=5)，表明方法精密度良好。

重復(fù)性試驗:精密稱取樣品粉末5份，各0.5 g，按照2.2項下方法制備供試品溶液5份，按照2.1項下色譜條件分別進樣10 μL。結(jié)果尿苷和腺嘌呤峰面積的 RSD分別為 2.43%和1.87%(n=5)，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液 10 μL，于 0，2，4，6，8，10，12 h時進樣測定。結(jié)果尿苷和腺嘌呤峰面積的 RSD分別為 1.26%和 1.33%(n=7)，表明供試品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的蟲草樣品粉末6份，每份約0.25 g，分別加入混合對照品適量，依法制成供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

精密吸取冬蟲夏草供試品溶液10 μL，按照2.1項下色譜條件測定。結(jié)果批號為20091218，20100407，20100511的樣品中尿苷含量分別為 6.54，6.49，6.52 mg/g，腺嘌呤含量分別為 1.39，1.41，1.40 mg/g。

3 討論

試驗比較了乙腈－水、甲醇－水、乙腈－磷酸鹽緩沖液、甲醇－磷酸鹽緩沖液為流動相，結(jié)果表明甲醇－水、乙腈－水分離效果均較好，考慮乙腈毒性較甲醇大且價格昂貴，選擇甲醇－水為流動相。為避免樣品中雜質(zhì)的干擾，經(jīng)反復(fù)試驗，確定甲醇－水最佳配比為5∶95，且避免了緩沖鹽作為流動相對儀器的影響。

以尿苷和腺嘌呤2個目標(biāo)成分的提取率為指標(biāo)，綜合考察提取溶劑、溶劑用量、超聲時間、超聲溫度等因素對試驗結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以20倍量的水超聲30 min即可基本提取完全。

采用高效液相色譜－紫外法(HPLC－UV，HPLC分析中最常規(guī)的檢測器)一次進樣同時測定尿苷和腺嘌呤含量，只需18 min即可完成整個分析過程。尿苷和腺嘌呤的含量反映藥材的質(zhì)量，可作為人工蟲草的質(zhì)量控制指標(biāo)，并且為人工蟲草替代野生蟲草資源提供參考。

[1]梁洪卉，程 舟，楊曉伶，等.HPLC定量分析冬蟲夏草的主要核苷類有效成分[J].中藥材，2008，31(1):58 －60.

[2]雷 寧，杜樹山，倪雪梅，等.RP－HPLC測定天然蟲草與人工蟲草中核苷類成分的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41(12):948－951.

[3]宋江峰，劉春泉，李大婧，等.HPLC－DAD測定人工北冬蟲夏草中蟲草素含量[J].食品科學(xué)，2008，29(4):352－354.

[4]鞠建明，錢大瑋，朱玲英，等.HPLC測定冬仙膠囊中蟲草素的含量[J].中成藥，2005，27(2):215 －216.

[5]劉小莉，周劍忠，王 英，等.蟲草發(fā)酵菌絲體中腺苷和蟲草素含量的檢測[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(12):2507 －2508.

[6]黃海燕，鐘建理，謝黔鋒，等.冬蟲夏草質(zhì)量控制方法研究概況[J].中國藥業(yè)，2010，19(9):88－90.