劉 哲，詹良靜，張新宜，王欣榮

(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都 610052)

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種同時(shí)具有γ-谷氨?；蛶€基生物活性的三肽化合物，具有氧化型和還原型兩種形態(tài)，可應(yīng)用于醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的是其還原態(tài)［1］。還原型谷胱甘肽具有重要的生理功能，例如抗氧化功能、對(duì)外來(lái)物質(zhì)的解毒功能和提高免疫力的功能，臨床上多作為保肝類藥物使用［2］。谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、生物法和提取法3種［3］。由于化學(xué)合成法得到的GSH消旋體(左旋體和右旋體的混合物)需要進(jìn)行光學(xué)拆分，分離十分困難且容易造成環(huán)境污染，因此化學(xué)合成法獲得的GSH產(chǎn)品純度不高。提取法主要是通過(guò)萃取和沉淀的方法從含有GSH的動(dòng)植物組織中分離提取，但是由于GSH在組織中含量極低、原料不易獲得、制取的GSH純度和收率不高等原因，導(dǎo)致該法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大［3］。生物法包括微生物發(fā)酵法和酶法，目前國(guó)外工業(yè)化生產(chǎn)GSH的主要方法是微生物發(fā)酵法，所應(yīng)用的菌種是釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母等能夠大量積累GSH的菌株［4-5］。發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的關(guān)鍵問(wèn)題在于如何在提高細(xì)胞密度的同時(shí)加大細(xì)胞內(nèi)GSH含量，二者有機(jī)結(jié)合將有利于生產(chǎn)效率的提高［6］。菌種選育是一種切實(shí)可行的提高胞內(nèi)GSH含量的方法，普通野生型酵母細(xì)胞內(nèi)GSH的含量并不高，只有采用物理的或化學(xué)的方法使出發(fā)菌株發(fā)生變異，才能使GSH在胞內(nèi)大量積累，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)GSH的高產(chǎn)［7］。在選育到優(yōu)良菌株的同時(shí)，還需要在發(fā)酵過(guò)程中設(shè)法提高細(xì)胞密度，以提高GSH的總產(chǎn)量。補(bǔ)料分批發(fā)酵是獲得酵母高細(xì)胞密度培養(yǎng)的最有效方法。在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入3種前體氨基酸將有利于提高胞內(nèi)GSH含量，進(jìn)而提高GSH產(chǎn)量［8-9］。本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母作為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變結(jié)合乙硫氨酸和氯化鋅的底物選擇篩選高產(chǎn)GSH釀酒酵母菌株，并利用10 L發(fā)酵罐研究了釀酒酵母高密度發(fā)酵工藝和前體氨基酸補(bǔ)加工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 出發(fā)菌株:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-001，由本研究組保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①平板及斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20，瓊脂20，pH自然;②種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20，pH自然;③發(fā)酵培養(yǎng)(g/L):甘蔗糖蜜120，(NH4)2HPO49，復(fù)合氨基酸5，甘氨酸2，半胱氨酸5，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 0.3，ZnCl20.5，pH自然;④乙硫氨酸氯化鋅選擇平板培養(yǎng)基:普通平板培養(yǎng)基+乙硫氨酸+氯化鋅。

1.1.3 試劑與儀器 乙硫氨酸購(gòu)自Sigma公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2010-LC型高效液相色譜儀(島津)、10 L微生物發(fā)酵罐(上海高機(jī)生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 從活化的菌種斜面上挑取1環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速280 r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行紫外誘變。

1.2.2 誘變方法 取10 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的釀酒酵母菌株，4 000 r/min離心10 min收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗2次，加入無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，梯度稀釋至菌體濃度在107cfu/mL左右，取5 mL菌懸液放置在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，在30 W紫外燈下距離30 cm照射一定時(shí)間，梯度稀釋并取0.1 mL涂布于平板培養(yǎng)基上(整個(gè)過(guò)程在紅外燈下操作)。30℃培養(yǎng)48 h后通過(guò)活菌數(shù)計(jì)算致死率。

1.2.3 篩選方法 紫外誘變的菌懸液經(jīng)梯度稀釋后取0.1 mL涂布到含有乙硫氨酸和氯化鋅的抗性篩選平板上，避光條件下30℃培養(yǎng)48 h，挑取生長(zhǎng)快、菌落大的菌株至斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h后接種至發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)72 h發(fā)酵后測(cè)定谷胱甘肽含量。

1.2.4 10L發(fā)酵罐發(fā)酵方法 將培養(yǎng)24 h的種子以10%接種量接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝液量為6 L，培養(yǎng)溫度30℃，攪拌速度300 r/min，通氣量為6 L/min。①一次性補(bǔ)料發(fā)酵:當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到18 h時(shí)一次性補(bǔ)入800 mL 50%的葡萄糖;②補(bǔ)料分批發(fā)酵:當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到18 h時(shí)自動(dòng)控制發(fā)酵液的pH值為5.5，根據(jù)發(fā)酵液pH的變化流加500 g/L的葡萄糖和10%的氨水，當(dāng)pH降低時(shí)加入氨水使pH升高，當(dāng)pH超過(guò)5.5時(shí)則補(bǔ)入葡萄糖;③補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)合前體氨基酸的補(bǔ)加:在補(bǔ)料分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上，當(dāng)菌絲量達(dá)到較高程度時(shí)一次性補(bǔ)入適量的半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸。實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程中的pH并通過(guò)取樣檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中的生物量、還原糖濃度、細(xì)胞內(nèi)GSH含量與GSH產(chǎn)量。

1.2.5 分析方法 ①胞內(nèi)GSH的提取發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后棄上清，加入10 mL去離子水，震蕩混勻后100℃水浴15 min，離心(12 000 r/min)4 min后取上清液用于HPLC分析;②HPLC條件:色譜柱 C18柱(4.6 mm×150 mm)，流動(dòng)相57 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(含庚烷磺酸鈉0.2%，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3)-甲醇(30∶1)，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波210 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL;③細(xì)胞干重的測(cè)定:發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后棄上清，用蒸餾水洗滌2遍，洗滌后的細(xì)胞在90℃烘干至恒重后稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變

2.1.1 紫外線誘變致死率及不同濃度乙硫氨酸和氯化鋅對(duì)菌株的致死率 按1.2.2方法對(duì)菌體進(jìn)行紫外線誘變處理，統(tǒng)計(jì)不同照射時(shí)間下菌體的致死率，同時(shí)取未經(jīng)照射的出發(fā)菌株為對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紫外線誘變的致死率曲線Fig.1 The mortality rate curve of UV radiation

如圖1所示，紫外線的照射時(shí)間與菌株的致死率存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸提高。但如果照射時(shí)間太長(zhǎng)，一些高活性菌株也可能致死，故一般選用致死率70%～80%左右的劑量。由圖1可以看出紫外照射時(shí)間為30 s時(shí)致死率達(dá)到78%，因此選擇30 s為適宜的紫外照射時(shí)間。乙硫氨酸是GSH的結(jié)構(gòu)類似物，由于菌體內(nèi)GSH可反饋抑制谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，故可使用乙硫氨酸作為底物篩選反饋抑制突變株;Zn2+是酵母細(xì)胞內(nèi)多種酶的輔酶或輔基，低濃度時(shí)可促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)，高濃度時(shí)可抑制多種酶的活性，從而引起酵母細(xì)胞的死亡［7，10］。不同濃度的乙硫氨酸和氯化鋅對(duì)菌株的致死率如表1所示。

表1 不同濃度的乙硫氨酸和氯化鋅對(duì)菌株的致死率Table1 The mortality rate of different concentrations of ethionine and zinc chloride to the strain

如表1所示，當(dāng)乙硫氨酸濃度為0.9 mg/mL時(shí)，菌株致死率為75%;當(dāng)ZnCl2濃度為0.5 mg/mL時(shí)，菌株致死率為72%。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)當(dāng)0.9 mg/mL乙硫氨酸與0.5 mg/mL的ZnCl2聯(lián)合使用時(shí)菌株的致死率為86.5%，致死率太高不利于高產(chǎn)GSH酵母菌株的篩選，故使用0.7 mg/mL的乙硫氨酸與0.4 mg/mL的ZnCl2，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)此濃度下菌株的致死率為73%，適用于下一步篩選。

2.1.2 紫外誘變結(jié)果 按1.2.3方法對(duì)誘變得到的酵母菌株進(jìn)行篩選，出發(fā)菌株作為對(duì)照。初篩得到145株酵母，經(jīng)發(fā)酵有63個(gè)菌株的GSH產(chǎn)量高于出發(fā)菌株，正變率達(dá)43.4%。選取GSH產(chǎn)量提高12%以上的11株酵母進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 紫外誘變高產(chǎn)GSH突變株復(fù)篩Table2 The rescreening of the mutant strain with higher GSH production

由表2可知，菌株SC-001-24的GSH產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高22%，胞內(nèi)GSH含量比出發(fā)菌株提高了19%。將SC-001-24連續(xù)傳代6次，每次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，觀察其遺傳穩(wěn)定性，在幾次傳代中，突變株SC-001-24的谷胱甘肽產(chǎn)量都比出發(fā)菌株提高18%以上，顯示了良好的遺傳穩(wěn)定性，故使用突變株SC-001-24作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

2.2 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果

2.2.1 一次性補(bǔ)料發(fā)酵 GSH是胞內(nèi)產(chǎn)物，其產(chǎn)量可以通過(guò)兩個(gè)途徑提高，一是采用高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提高其生物量;二是提高胞內(nèi)GSH含量［6］。按1.2.4的方法進(jìn)行一次性補(bǔ)料發(fā)酵，圖2是一次性補(bǔ)料發(fā)酵的參數(shù)曲線，由圖2可見(jiàn)發(fā)酵第18 h補(bǔ)加葡萄糖后發(fā)酵液中還原糖濃度由27 g/L上升至84 g/L，如此高濃度的還原糖能保證整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中菌體對(duì)糖的需要。一次性補(bǔ)料發(fā)酵在一定程度上類似于對(duì)搖瓶發(fā)酵的模擬，這種發(fā)酵方式并不能充分發(fā)揮發(fā)酵罐精確控制的優(yōu)勢(shì)，也很難達(dá)到細(xì)胞高密度培養(yǎng)的目的。由圖2可知在發(fā)酵進(jìn)行到18 h后發(fā)酵液的pH一直低于4，這種過(guò)酸性的環(huán)境不利于細(xì)胞的生長(zhǎng);細(xì)胞最大生物量出現(xiàn)在第48 h，為34.5 g/L;GSH最高產(chǎn)量在54 h，為402.4 mg/L;細(xì)胞內(nèi)GSH含量最高達(dá)到1.21%。從發(fā)酵結(jié)果來(lái)看，GSH產(chǎn)量與細(xì)胞生物量均過(guò)低，遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

圖2 一次性補(bǔ)料發(fā)酵曲線Fig.2 The course of batch culture

2.2.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵 發(fā)酵罐在通氣量控制、補(bǔ)料控制、pH控制等方面具有搖瓶試驗(yàn)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)將發(fā)酵液pH控制在5.5的恒PH發(fā)酵具有緩和底物抑制、富集高濃度細(xì)胞、克服Crabtree效應(yīng)以及延長(zhǎng)操作時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)［6，11］。按1.2.4的方法進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，根據(jù)發(fā)酵液pH的變化流加500 g/L的葡萄糖和10%的氨水，使發(fā)酵液中始終保持較低的葡萄糖濃度，至60 h流加結(jié)束，72 h培養(yǎng)結(jié)束。由圖3可知，pH自動(dòng)控制在5.5之后，大部分時(shí)間還原糖的濃度低于10 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一次性補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)的還原糖最低水平，這種低還原糖控制策略減少了乙醇的生成，而發(fā)酵過(guò)程中乙醇的產(chǎn)生是不利于GSH在細(xì)胞內(nèi)的積累［11］。細(xì)胞生物量最高達(dá)到47.5 g/L，GSH產(chǎn)量最高達(dá)到1 080.8 mg/L，胞內(nèi)GSH含量最高達(dá)到2.29%分別比一次性補(bǔ)料發(fā)酵提高了37.7%、168.6%與89.3%。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程共補(bǔ)入560 g葡萄糖，GSH的最高產(chǎn)量出現(xiàn)在66 h，此時(shí)胞內(nèi)GSH含量最高，而細(xì)胞生物量略低于最高峰。

圖3 補(bǔ)料分批發(fā)酵曲線Fig.3 The course of fed-batch culture

2.2.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)合前體氨基酸補(bǔ)加 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加3種前體氨基酸有利于GSH的積累，但Cys的加入能抑制釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終降低細(xì)胞生物量［9，12］。根據(jù)前期的搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)(搖瓶裝液量25 mL/250 mL)確認(rèn)在發(fā)酵結(jié)束前24 h細(xì)胞生物量達(dá)到較高程度時(shí)一次性補(bǔ)入半胱氨酸1.03 mmol、甘氨酸0.67 mmol和谷氨酸0.34 mmol，有利于GSH的積累，同時(shí)對(duì)細(xì)胞生物量影響較小，因此根據(jù)搖瓶試驗(yàn)結(jié)果選擇在發(fā)酵中后期補(bǔ)加3種前體氨基酸，3種前體氨基酸的補(bǔ)加濃度參考搖瓶試驗(yàn)結(jié)果，分別為半胱氨酸41 mmol/L、甘氨酸26.7 mmol/L、谷氨酸13.7 mmol/L。不同的3種前體氨基酸補(bǔ)加時(shí)間對(duì)GSH發(fā)酵的影響如表3所示，發(fā)酵進(jìn)行到40 h和44 h補(bǔ)加3種前體氨基酸對(duì)GSH的產(chǎn)量提高最有利，此時(shí)細(xì)胞生物量在37.58 mg/L與39.01 mg/L之間，因此選擇當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至40 h到44 h之間補(bǔ)加3種前體氨基酸。進(jìn)一步對(duì)3種前體氨基酸補(bǔ)加時(shí)間進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。

表3 3種前體氨基酸補(bǔ)加時(shí)間對(duì)GSH發(fā)酵的影響Table3 The influence of different addition time of the three precursor amino acids to GSH production

圖4 補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)合前體氨基酸補(bǔ)加Fig.4 The course of fed-batch culture combined with precursor amino acids addition

所示，當(dāng)發(fā)酵42 h細(xì)胞生物量達(dá)到37.69 g/L時(shí)補(bǔ)入半胱氨酸246 mmol、甘氨酸160 mmol、谷氨酸82 mmol，6 h內(nèi)GSH產(chǎn)量由350.5 mg/L提高至958.7 mg/L。GSH的最高產(chǎn)量出現(xiàn)在60 h，為1 280.4 mg/L，比未補(bǔ)加前體氨基酸時(shí)提高了18.5%。細(xì)胞最大生物量為43.96 g/L，比未補(bǔ)加前體氨基酸時(shí)略低，但胞內(nèi)GSH含量最高為2.91%，比未補(bǔ)加前體氨基酸時(shí)提高了 27%。GSH的最高產(chǎn)量出現(xiàn)在發(fā)酵60 h，而未補(bǔ)加前體氨基酸時(shí)GSH最高產(chǎn)量出現(xiàn)在發(fā)酵66 h，可見(jiàn)前體氨基酸的補(bǔ)加不僅能夠提高發(fā)酵液中GSH的產(chǎn)量，而且能夠縮短發(fā)酵時(shí)間。

3 討論

利用紫外誘變結(jié)合乙硫氨酸和氯化鋅的底物篩選可有效篩選出有較高GSH產(chǎn)量的釀酒酵母菌株，經(jīng)過(guò)2輪誘變篩選到突變株SC-001-24，其GSH產(chǎn)量為743 mg/L，比出發(fā)菌株提高了22%。通過(guò)在10 L發(fā)酵罐中對(duì)突變株SC-001-24的發(fā)酵調(diào)控發(fā)現(xiàn)把發(fā)酵液pH控制在5.5的恒PH補(bǔ)料分批發(fā)酵能夠有效提高GSH的產(chǎn)量，GSH產(chǎn)量達(dá)到1 080.8 mg/L。結(jié)合前體氨基酸的補(bǔ)加，釀酒酵母菌株SC-001-24發(fā)酵生產(chǎn)GSH的最高產(chǎn)量可達(dá)1 280.4 mg/L，顯示了良好的應(yīng)用前景。

［1］Harington CR，Mead TH.Synthesis of Glutathione［J］.Biochem J，1935，29(1):1602-1611.

［2］程元愷.谷胱甘肽的解毒作用與毒性代謝物［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1994，21(5):395-399.

［3］Yin Li，Gongyuan Wei，Jian Chen.Glutathione:a review on biotechnological production［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，66(3):233-242.

［4］Penninckx MJ.An overview on glutathione in Saccharomyces versus non-conventional yeasts［J］.FEMS Yeast res，2002，2(3):295-305.

［5］趙波，趙文杰，顧敏，等.硫酸銨與pH對(duì)酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的影響［J］.微生物藥物與生物技術(shù)，2009，40(3):180-182.

［6］Shaohong Wen，Tao Zhang，Tianwei Tan.Maximizing production of glutathione by amino acid modulation and high-cell-density fed-batch culture ofSaccharomyces cerevisiae［J］.Process Biochemistry，2006，41(12):2424-2428.

［7］童群義，陳堅(jiān)，李華鐘.高產(chǎn)谷胱甘肽的酵母菌選育及其培養(yǎng)條件研究［J］.工業(yè)微生物，2002，32(2):13-17.

［8］Miaomiao Wang，Jinggeng Sun，Tianwei Tan，et al.The effect of intracellular amino acids on GSH production by high-celldensity cultivation ofSaccharomyces cerevisiae［J］.Appl Biochem Biotechnol，2012，168(1):198-205.

［9］Shaohong Wen，Tao Zhang，Tianwei Tan.Optimization of amino acid composition in glutathione fermentation［J］.Process Biochemistry，2005，40(11):3474-3479.

［10］胡林華，譚天偉.高產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌株的選育和培養(yǎng)條件的初探［J］.高校化學(xué)工程學(xué)報(bào)，2005，19(2):273-276.

［11］Zheng Wang，Tianwei Tan，Jie Song.Effect of amino acids addition and feedback control strategies on the high-cell-density cultivation ofSaccharomyces cerevisiaefor glutathione production［J］.Process Biochemistry，2007，42(1):109-111.

［12］Alfafala CG，Kanda A，Shioi T，et al.Effect of amino acids on glutathione production bySaccharomyces cerevisiae［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1992，36(2):538-540.