徐小婧，王俊平，王霄雪，談超，王碩，張燕

（天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

T-2 毒素為白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)150 ℃～151 ℃，難溶于水，易溶于極性溶劑，如三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯等。烹調(diào)過程不易將其破壞。分子式為C24H34O9，分子量為466?；窘Y(jié)構(gòu)為四環(huán)的半倍萜，C-9 和C-10 位上有不飽和雙鍵，在紫外燈下不顯熒光。

T-2 毒素（T-2 toxin）是真菌毒素之一，屬于單端孢霉烯族化合物中的A 族。是該類化合物中毒性最強(qiáng)的毒素之一。在近年來被確定為大骨節(jié)病、食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥的致病因子。毒性分級(jí)為劇毒，有明顯的細(xì)胞毒和對(duì)蛋白質(zhì)、DNA 合成的抑制作用，并有肯定的致畸性和致突變性[1-2]。主要污染小麥、玉米、大麥、燕麥和黑麥等谷物及麥芽、啤酒等食品，在美洲、歐洲等各洲的谷物中廣泛存在，國(guó)內(nèi)報(bào)道在大骨節(jié)病病區(qū)小麥和玉米中均有檢出[3]。目前國(guó)際上對(duì)T-2 毒素制訂的限量標(biāo)準(zhǔn)不多，前蘇聯(lián)等多國(guó)規(guī)定在糧食中允許標(biāo)準(zhǔn)為100 μg/kg[4]。

有關(guān)T-2 毒素的檢測(cè)方法等的研究，國(guó)內(nèi)外開展的比較多。目前，檢測(cè)糧谷類食品和飼料中T-2 毒素的方法主要有薄層色譜法（TLC）、液相色譜法（LC）、氣相色譜法（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）等。傳統(tǒng)分析方法需要昂貴的儀器，對(duì)技術(shù)人員要求高，樣品需經(jīng)過繁瑣的前處理，成本高，分析速度慢，很難達(dá)到快速、簡(jiǎn)便和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求，更難以適應(yīng)大量復(fù)雜樣品的檢測(cè)。而膠體金免疫層析方法具有簡(jiǎn)便快速、靈敏直觀、無需儀器等特點(diǎn)，因此被廣泛地應(yīng)用于快速檢測(cè)，臨場(chǎng)檢測(cè)等領(lǐng)域。但采用膠體金免疫層析法快速半定量測(cè)定T-2 毒素少有報(bào)道。本試驗(yàn)根據(jù)膠體金免疫層析試驗(yàn)（GICA）原理成功研制出T-2 毒素膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條，建立了一種快速、有效的T-2 毒素檢測(cè)方法，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

T-2 毒素（T-2 toxin）、卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白（BSA）、琥珀酸酐（HS）、二甲基酰胺（DMF）、二抗（羊抗兔）：Sigma 公司；抗T-2 毒素兔多克隆抗體：天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室免疫純化得到；氯金酸（HAuCl4）：Acoros 公司；檸檬酸三鈉：Fluka 公司；聚乙二醇（PEG20000）：Biobasic 公司；Millipore 硝酸纖維素膜H180（NC 膜）、玻璃纖維膜、PVC 底板、吸水紙均購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；甲醇、氯化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉：天津化學(xué)試劑六廠；磷酸鹽緩沖液PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）。

旋蒸儀：瑞典Buchi 公司；超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore 公司；低溫高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf 公司；雙維平面華劃膜儀、全自動(dòng)斬切機(jī)：上海金標(biāo)生物科技有限公司；真空干燥箱：三水公司。

1.2 方法

1.2.1 T-2 毒素完全抗原的制備

1）半抗原的合成參考Chu[5]的方法：取5 mg T-2毒素溶于1 mL 無水吡啶中，加入105 mg 琥珀酸酐，在油?。?05 ℃）的條件下反應(yīng)4 h。反應(yīng)物減壓干燥后溶于氯仿，水洗4 次。氯仿層旋干，即得到T-2 HS 結(jié)合物。

2）T-2 HS 結(jié)合物與載體蛋白的連接采用活化酯法[6]：稱取5 mg T-2 HS 與1.27 mg N-羥基琥珀酰亞胺溶于1 mL 無水四氫呋喃中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入2.27 mg N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺，室溫，反應(yīng)過夜。反應(yīng)物在相對(duì)離心力450 g，離心15 min。取上清液旋干。得到活化酯，質(zhì)譜鑒定產(chǎn)物。

3）稱取5 mg OVA 溶于1 mL 磷酸氫二鉀緩沖液（50 mmol/L K2HPO4，pH 9.3）中，取制備的活化酯溶液90 μL 緩慢滴加到蛋白緩沖液中，過程要在冰浴中進(jìn)行，滴加完畢后放入4 ℃冷藏柜反應(yīng)過夜，取出后在室溫下放置1 h～2 h，將連接液裝入透析袋，用PBS 溶液透析3 d，每天換3 次。收集透析后液體加入10 μL 的0.01 mg/L 的疊氮鈉，分裝后-20 ℃保存。

1.2.2 膠體金的合成與表征

取100 mL 氯金酸溶液（1.0×10-4g/mL）置于250 mL的錐形瓶中，在磁力攪拌的同時(shí)加熱至沸騰，沸騰后迅速加入檸檬酸鈉水溶液（濃度為0.01 g/mL）2 mL，5 min之內(nèi)顏色變化并且穩(wěn)定，后繼續(xù)加熱15 min，之后移去熱源，室溫放置至冷卻，最后用去離子水補(bǔ)充失去的水分，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1）肉眼觀察：用肉眼觀察所制得的膠體金溶液，觀察其顏色、均勻度和透明度。

2）可見光光度法：用紫外可見光分光光度儀對(duì)膠體金在紫外可見光范圍內(nèi)（200 nm～600 nm）進(jìn)行掃描，獲得膠體金紫外可見光吸收光譜，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)、吸光值和峰寬。

3）掃描電鏡：在掃描電鏡下觀察膠體金顆粒的大小是否均勻一致，有無不規(guī)則形狀。拍片放大后測(cè)量膠體金顆粒直徑大小，取多個(gè)點(diǎn)計(jì)算膠體金顆粒的平均直徑（由天大科技園完成）。

1.2.3 膠體金標(biāo)記抗體蛋白

因?yàn)槟z體金是膠體，所以當(dāng)含有電解質(zhì)時(shí)會(huì)造成膠體金的聚沉，所以應(yīng)該盡量保證抗體中較低的含鹽量，這樣標(biāo)記前抗體必須徹底除鹽，將待標(biāo)記的T-2毒素多克隆抗體置入透析袋中在雙蒸水或極低濃度的鹽水（5 mmol/L NaCl，pH 7.0）中4 ℃透析過夜，除去多余的鹽離子[7]。

量取10 mL 膠體金溶液，將pH 調(diào)至8.5，在攪拌狀態(tài)下向其中逐滴加入200 μL 濃度為1 mg/mL 的除鹽抗體，保持?jǐn)嚢? h，加入200 μL 濃度為0.2 g/mL BSA 水溶液及100 μL 濃度為0.1 g/mL PEG20000 水溶液作為穩(wěn)定劑，繼續(xù)攪拌0.5 h。

1.2.4 金標(biāo)記抗體的純化及表征

在4 ℃低溫下，先2 000 r/min 低速離心15 min，吸取上清液；然后將所得上清液以12 000 r/min 高速離心30 min，仔細(xì)吸出上清；底層紅色液體用金標(biāo)儲(chǔ)存液重懸為原體積1/10，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將與抗體標(biāo)記的膠體金溶液與未標(biāo)記的膠體金溶液在紫外下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，觀察波形變化，判斷是否標(biāo)記成功。

1.2.5 層析條件的優(yōu)化

1）分別對(duì)二抗、包被原、金標(biāo)抗體的包被量進(jìn)行優(yōu)化。

2）對(duì)包被原稀釋液及包被條件進(jìn)行優(yōu)化。

3）對(duì)金標(biāo)墊的干燥方式、金標(biāo)墊泡墊配方及封閉NC 膜的封閉液做優(yōu)化。

1.2.6 試紙條的組裝

將樣品墊、金標(biāo)墊、已包被好抗原抗體的NC 膜、吸水紙依次粘貼到PVC 底板上，切割成條，用封口袋密封，置于干燥器中常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 試紙條的檢測(cè)方法與最低檢測(cè)限的確定

將試紙條插入樣品液中，待樣品液浸潤(rùn)金標(biāo)墊后取出平放10 min 后觀察。如果檢測(cè)線、質(zhì)控線上均出現(xiàn)紅色條帶，說明樣品呈陰性；如果只有質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶說明樣品呈陽性；如果質(zhì)控線上無條帶，說明試紙條失效。

用甲醇稀釋T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)品至10 mg/L，然后用優(yōu)化好的標(biāo)品稀釋液分別稀釋濃度至5、10、50、100、200 ng/mL，并設(shè)一個(gè)空白陰性對(duì)照，插入試紙條，10 min判定結(jié)果，每個(gè)濃度重復(fù)6 次。取質(zhì)控線剛好消失的濃度為最低檢測(cè)限。

1.2.8 試紙條的穩(wěn)定性與重復(fù)性確定

取同批次試紙條分別置于4 ℃與37 ℃作7 d 對(duì)照試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)做3 次。取不同批次及批間的試紙條作對(duì)照試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金的合成與質(zhì)量鑒定

膠體金的制備過程和膠體金探針的標(biāo)記是獲得可靠結(jié)果的關(guān)鍵，在其膠體金制備的過程當(dāng)中應(yīng)特別注意用于制備膠體金的玻璃器皿必須非常清潔，特別要防止油脂污染，這是因?yàn)椴ＡП砻嫘誀顚?duì)還原過程的成功與否有重要作用，如果有少量的污染就會(huì)影響金顆粒的生成，造成顆粒大小不一或液體混濁。所制備的膠體金溶液如出現(xiàn)渾濁、聚集、沉淀、顆粒不均，都是不符合標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)的[8]，一概不能使用。檸檬酸鈉還原法是合成膠體金的經(jīng)典方法，膠體金顆粒尺寸、粒徑分布、晶體結(jié)構(gòu)和分散度都受到反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，而影響反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的因素又包括還原劑的用量、反應(yīng)溫度、pH 等[9]。本實(shí)驗(yàn)通過篩選最終選擇20 nm 的膠體金作為標(biāo)記物。

用肉眼觀察，可見膠體金溶液外觀呈深紅色，色澤均勻清亮，表面沒有漂浮物。膠體金溶液500 nm～600 nm 的紫外可見光掃描圖譜如圖1。

由圖1 可知，只有一個(gè)最大的吸收峰λmax=520 nm，最大吸收峰峰值為1.625，而且制備的膠體金溶液峰寬較小，波形光滑，說明制得的膠體金溶液的顆粒大小比較均勻。

圖2 為膠體金的掃描電鏡圖。

圖1 膠體金的可見光吸收光譜Fig.1 Visible-light absorbance spectrum of colloidal gold

圖2 膠體金電鏡掃描圖（Bar=100 nm）Fig.2 Determination of colloidal gold by scanning electron microscope

由圖2 可知，可以觀察到膠體金顆粒粒徑比較均一，且無橢圓形和多角形的金顆粒存在，放大后取多點(diǎn)測(cè)量膠體金粒徑為20 nm。

2.2 金標(biāo)抗體的質(zhì)量鑒定

將與抗體標(biāo)記的膠體金溶液與未標(biāo)記的膠體金溶液在紫外下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見圖3，上面的峰為標(biāo)記后的膠體金溶液在紫外下的吸收峰，下邊的峰為未標(biāo)記的膠體金溶液在紫外下得吸收峰。

圖3 紫外可見掃描抗體標(biāo)記膠體金Fig.3 Ultraviolet light absorbance spectrum of colloidal gold labeled with T-2 toxin Ab

由圖3 可見，膠體金溶液在紫外下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到最大的吸收波長(zhǎng)是520 nm，膠體金標(biāo)記了T-2毒素多克隆抗體后，其最大吸收峰出現(xiàn)了位移，在540 nm 處波長(zhǎng)出現(xiàn)，有此判斷抗體已經(jīng)標(biāo)記上了膠體金。

2.3 層析條件的確定

1）對(duì)二抗稀釋倍數(shù)、包被原稀釋倍數(shù)、金標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)做正交試驗(yàn)優(yōu)化，最終確定三者所用的稀釋倍數(shù)分別為1 ∶600、1 ∶1、1 ∶20。

2）由于T-2 毒素微溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。在包被原稀釋液中加入一定量的甲醇有利于包被原與NC 膜更穩(wěn)固的結(jié)合。最終優(yōu)化用3%的甲醇PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）溶液稀釋包被原包被于NC 膜上。為了縮短包被時(shí)間，采用了烘箱37 ℃包被1 h。

3）金標(biāo)墊經(jīng)噴金后分別放于室溫、37 ℃鼓風(fēng)烘箱、37 ℃真空干燥箱進(jìn)行干燥，最終37 ℃真空干燥箱干燥效果最好，金標(biāo)抗體釋放完全。在金標(biāo)抗體釋放過程中，蔗糖與BSA 的加入可以起到整體增色的效果，Tween20 等表面活性劑的加入可以加速金標(biāo)抗體的釋放速度，所以采取10%蔗糖，5%BSA，0.1%Tween 20，0.1%NaN3的金標(biāo)墊泡墊配方，在噴金前預(yù)先泡墊。同時(shí)為盡量減少NC 膜的非特異性吸附選用含1 %BSA 的PBS 緩沖液對(duì)NC 膜進(jìn)行封閉。

2.4 最低檢測(cè)限的確定

采用已優(yōu)化好的條件，制備好免疫層析試紙條測(cè)定T-2 毒素的最低檢測(cè)限，結(jié)果見圖4。

圖4 T-2 毒素檢測(cè)限的確定Fig.4 Assay sensitivities for T-2 toxin

如圖4 所示，T-2 毒素標(biāo)品濃度為50 ng/mL 時(shí)質(zhì)控線恰好消色，此即為試紙條方法的最低檢測(cè)限。

2.5 方法檢測(cè)的特異性

將HT-2 毒素，赭曲霉毒素A，伏馬毒素B1，黃曲霉毒素B1等溶于含3%甲醇的PBS（pH 7.4，0.01 mol/L），配成1 000 ng/mL 濃度，然后用檢測(cè)試劑檢測(cè)。結(jié)果表明，本檢測(cè)試劑與以上物質(zhì)在1 000 ng/mL 濃度時(shí)沒有交叉反應(yīng)。因此本檢測(cè)試劑可以通過觀察試劑上檢測(cè)線的有無及顏色變化進(jìn)行定性檢測(cè)，對(duì)T-2 毒素具有較高的特異性。

2.6 重復(fù)性及穩(wěn)定性的確定

隨機(jī)抽取不同批次和批間制備的試紙條進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果基本一致。說明該方法重復(fù)性好。

采用加速試驗(yàn)進(jìn)行穩(wěn)定性研究，37 ℃保存7 d 相當(dāng)于4 ℃保存6 個(gè)月[10]。研究發(fā)現(xiàn)，膠體金標(biāo)記抗體在37 ℃保存4 d 后，試紙條的質(zhì)控線顏色明顯變淺，檢出限降低至25 ng/mL，說明金標(biāo)抗體在3 個(gè)月的保存期內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論與展望

目前，食品中T-2 毒素的檢測(cè)方法很多，但各有其優(yōu)缺點(diǎn)。本試驗(yàn)研制的T-2 毒素免疫層析試紙條靈敏度高、重復(fù)性較好，具有檢測(cè)快速，操作簡(jiǎn)單，無需專業(yè)人員或儀器檢測(cè)，目測(cè)即可觀察結(jié)果，適用于快速檢測(cè)及臨場(chǎng)檢測(cè)。

分析穩(wěn)定性較差的原因可能是因?yàn)門-2 包被原在儲(chǔ)藏的過程中T-2 毒素從大蛋白分子上脫落，這是由于T-2 毒素連接蛋白分子的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，可進(jìn)一步選用其他更好的接臂方式制備半抗原連接蛋白做包被原?？蛇M(jìn)一步將T-2 毒素試紙條應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)中。

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