方 艷 吳肖曉 應(yīng)小平 趙延紅 郭蘭生 王小平 陜西中醫(yī)學(xué)院分子病理研究室（咸陽(yáng)712046）

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 6～8 周齡SD 大鼠10 只，體重250g±5g，雌、雄各半，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（軍）2002－005；S－180瘤細(xì)胞株，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥品與試劑 山仙顆粒（SXG）：陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心提供（生產(chǎn)日期090328）。主要試劑：fasl多克隆抗體、fasl－FITC熒光抗體及二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒PV6002、DAB顯色劑（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器 水平離心機(jī)（LD－42型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)賓得公司CD－150），光學(xué)顯微鏡（尼康DXM1200F），倒置顯微鏡（尼康TS100）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備大鼠SXG 含藥血清 將山仙顆粒配成0.5g／mL的混懸液，隨機(jī)選取SD 大鼠5只（體重250±5g），按大鼠5g／kg·d（相當(dāng)于臨床等效劑量10倍）給藥，0.75mL／次，于上午9點(diǎn)及下午3點(diǎn)各灌胃服藥1次，連續(xù)7d。于末次給藥后2h后，3%戊巴比妥鈉0.15mL／100g－1腹腔注射麻醉，頸動(dòng)脈取血，離心取血清，56℃、30min滅活補(bǔ)體，除菌過(guò)濾后，－20℃分裝凍存。

2.2 制備正常大鼠血清 隨機(jī)選取正常SD 大鼠5只（體重250±5g），灌胃等量生理鹽水，方法同上。

2.3 S－180細(xì)胞體外培養(yǎng) 采用MTT 法，將S－180細(xì)胞用含青霉素G100U·mL－1、鏈霉素100mg·L－1的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成5×105·mL－1瘤細(xì)胞懸液，向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入1800μL瘤細(xì)胞懸液；依次再于對(duì)照組加入200μL 小牛血清，空白血清1組加入200μL正常SD 大鼠血清，空白血清2組加入20μL正常SD 大鼠血清及180μL小牛血清，含藥血清1組（小劑量組）加入20μL山仙顆粒SD 大鼠含藥血清及180μL小牛血清，含藥血清2組（大劑量組）加200μL 山仙顆粒SD 大鼠含藥血清；每一濃度設(shè)3復(fù)孔。37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)fasl的表達(dá) 于24h、48h、72h分別收集各組S－180細(xì)胞，離心沉淀，采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP（His－tostain－Plus）法檢測(cè)fasl的表達(dá)：將收集的S－180細(xì)胞制成細(xì)胞涂片，常規(guī)水化－PBS洗片（5min×3 次）－0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶（室溫10min）－PBS洗片（5min×2次）－微波加熱法修復(fù)抗原－PBS洗片（3min×3次）－加入fasl兔抗鼠多克隆抗體（1∶100，4℃、濕盒過(guò)夜）－PBS洗片（3min×3次）－加入生物素化羊抗兔第二抗體（1∶200，37℃、40min）－PBS洗片（3min×3次）－加入封閉液（37℃、30min）－PBS洗片（3min×3次）－顯色（0.04%DAB＋0.03%H2O2，10min）－水洗（5min）－蘇木素襯染－常規(guī)脫水、透明－中性樹(shù)膠封片。每例標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野（×400），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)fasl的表達(dá) 方法同上，一抗直接加入fasl－FITC熒光抗體，5min內(nèi)快速避光后在熒光顯微鏡下觀察，胞膜和胞漿見(jiàn)綠色熒光者判定為陽(yáng)性細(xì)胞。每個(gè)樣本隨機(jī)抽取8個(gè)高倍視野（×400），攝取圖象并評(píng)分。判斷標(biāo)準(zhǔn)：熒光亮度一般分為4級(jí)，即“－”無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光?！埃眱H能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光?！埃泵髁恋臒晒?。“＋＋＋”耀眼的熒光，具體標(biāo)準(zhǔn)由觀察者掌握；計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為陰性記0分、（＋）記1分、（＋＋）記2分，（＋＋＋）記3分。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果 見(jiàn)下表。

表1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)S－180細(xì)胞fasl的表達(dá)（±s）

表1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)S－180細(xì)胞fasl的表達(dá)（±s）

注：含藥血清2組與空白血清2組比較fasl表達(dá)水平下降，△P＜0.05

陽(yáng)性細(xì)胞百分率（%）組 別24h48h72h對(duì)照組63.5±4.3 60.0±6.0 61.2±2.8空白血清1組 64.0±5.1 60.3±3.6 59.0±3.1含藥血清1組 63.6±3.2 64.0±3.6 62.2±3.6空白血清2組 61.4±1.6△60.6±6.1△61.6±3.4△含藥血清2組 52.9±3.4△47.4±2.3△45.6±4.4△

表2 免疫熒光法檢測(cè)S－180細(xì)胞fasl的表達(dá)熒光強(qiáng)度評(píng)分（±s）

表2 免疫熒光法檢測(cè)S－180細(xì)胞fasl的表達(dá)熒光強(qiáng)度評(píng)分（±s）

注：含藥血清2組與空白血清2組比較fasl表達(dá)水平下降，△P＜0.05

24h48h72h對(duì)照組組 別2.82±0.41 2.78±0.39 2.90±0.34空白血清1組 2.88±0.31 2.93±0.40 2.88±0.38含藥血清1組 2.79±0.42 2.83±0.53 2.80±0.58空白血清2組 2.92±0.35△ 2.88±0.63△ 2.89±0.44△含藥血清2組 1.35±0.43△ 1.18±0.42△ 1.24±0.23△

4 結(jié) 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的主動(dòng)死亡，也叫程序性細(xì)胞死亡，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。該過(guò)程是受眾多基因調(diào)控的，其中fas和fasl是一組重要的抑癌基因，fas（CD95）又稱自殺相關(guān)因子，屬腫瘤壞死因子受體及神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族成員，可表達(dá)于體內(nèi)許多類型細(xì)胞表面，如活化的T／B 細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞等［1］。fasl是fas的天然配體，構(gòu)成了fas／fasl系統(tǒng)，二者結(jié)合后即出現(xiàn)凋亡信號(hào)，導(dǎo)致表達(dá)fas的細(xì)胞發(fā)生凋亡［2］。近年研究表明多種腫瘤細(xì)胞Fas表達(dá)水平下調(diào)或缺失，借以逃避宿主免疫細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡；而Fasl表達(dá)水平往往升高，促使瘤細(xì)胞殺死與之接觸的免疫活性細(xì)胞，兩者協(xié)同通過(guò)營(yíng)造局部免疫豁免（immune privilege）來(lái)逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視［3］。實(shí)驗(yàn)研究亦顯示肝癌細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)fasL，和活化的抗腫瘤T 細(xì)胞fas結(jié)合后，導(dǎo)致T 細(xì)胞凋亡［4］。張妍等研究發(fā)現(xiàn)Fals蛋白表達(dá)水平增高，癌細(xì)胞的惡性程度隨之增加，其逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的能力也逐步增強(qiáng)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性加大［5］。還有研究表明fasl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后等關(guān)系密切［6，7］。由此可見(jiàn)，了解腫瘤細(xì)胞fasL 表達(dá)的情況及發(fā)現(xiàn)作用于fasL靶點(diǎn)的藥物，對(duì)于腫瘤的診斷、治療具有重大意義。

中醫(yī)藥以其多機(jī)制、多靶點(diǎn)、多途徑等優(yōu)勢(shì)顯示了在惡性腫瘤臨床治療的重要性，基于“扶本培正、活血化瘀”兩大基本治療法則的基礎(chǔ)上研制的，由西洋參、仙鶴草、生山楂等組成的復(fù)方中藥制劑山仙顆粒，經(jīng)以往的臨床觀察及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，具有顯著的抑瘤、抗轉(zhuǎn)移、防復(fù)發(fā)作用［8、9］。而且該方中的單味藥如西洋參、莪術(shù)、鱉甲、仙鶴草、生山楂等的現(xiàn)代藥理研究均顯示有一定的抑瘤并促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［10－14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SD 大鼠山仙顆粒含藥血清大劑量組能明顯下調(diào)S－180細(xì)胞fasl的表達(dá)，那么山仙顆粒的臨床應(yīng)用取得的良好療效，可能是通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞fasL 的表達(dá)水平，從而減少了對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的攻擊和殺傷，加強(qiáng)了機(jī)體的免疫監(jiān)視作用，實(shí)現(xiàn)了其抑瘤、抗轉(zhuǎn)移、防復(fù)發(fā)的顯著療效。下面我們將進(jìn)一步研究該方可否影響惡性腫瘤患病機(jī)體的免疫系統(tǒng)各細(xì)胞系的fas／fasL系統(tǒng)，為中醫(yī)藥抗腫瘤機(jī)制研究提供更多的理論依據(jù)。

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