黃 晨,丁一剛,杜治平,黃麗明,王 超,沈瓊璐,孟慶嶺

(武漢工程大學 綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室湖北省新型反應器與綠色化學工藝重點實驗室,湖北武漢430073)

左磷右胺鹽制備磷霉素鈉工藝的優(yōu)化研究

黃 晨,丁一剛,杜治平,黃麗明,王 超,沈瓊璐,孟慶嶺

(武漢工程大學 綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室湖北省新型反應器與綠色化學工藝重點實驗室,湖北武漢430073)

以左旋磷霉素右旋苯乙胺鹽為原料與氫氧化鈉反應制備磷霉素鈉(FS),考察了反應溫度、投料時間、保溫時間、氫氧化鈉濃度、原料配比等因素對磷霉素鈉收率的影響,并優(yōu)化了磷霉素鈉的析晶條件。確定適宜的合成工藝條件為:反應溫度37～38℃、投料時間20 min、保溫時間60 min、氫氧化鈉濃度5 mol·L-1、左磷右胺鹽與氫氧化鈉摩爾比1∶1.7,在此條件下,磷霉素鈉的收率達85.4%。用無水乙醇在60℃、磷霉素鈉投料量與乙醇用量比為1∶4(mol∶L)的條件下可析出晶型良好的磷霉素鈉結晶粉末。

磷霉素鈉;合成;工藝優(yōu)化

磷霉素(Fosfomycin,FOM)藥物是一類療效僅次于青霉素類的新型廣譜抗菌藥,分子結構與磷酸烯醇丙酮酸相似,可與細菌競爭同一轉移酶,使細菌細胞壁合成受到抑制而導致細菌死亡[1-3]。磷霉素不僅對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有一定的抗菌作用,而且藥效溫和,發(fā)生過敏性休克的機會甚少,因此應用范圍十分廣泛,主要用于治療尿路、皮膚、軟組織以及腸道等部位的感染[4-6]。磷霉素不穩(wěn)定,通常以鈣、鈉等金屬鹽形式存在[7]。作為最廣泛使用的磷霉素藥物,磷霉素鈉(Fosfomycin sodium,FS)因其強的水溶性克服了磷霉素鈣溶解度小、難吸收的缺點,通常以注射液的形式作用于人體[8-10]。

適宜人體環(huán)境的中性磷霉素鈉的制備方法有甲醇鈉法、交換樹脂法和氫氧化鈉法等。甲醇鈉法是以甲醇為溶媒,使左旋磷霉素右旋苯乙胺鹽(以下簡稱左磷右胺鹽,用FMC表示)與甲醇鈉反應,然后用丙酮析晶,得到一鈉鹽含量60%～65%、二鈉鹽含量40%～35%的中性磷霉素鈉,但生成的苯乙胺不僅溶于甲醇、不易回收,還可與丙酮反應影響純度[11]。交換樹脂法是由左磷右胺鹽與氫氧化鈉反應制得堿性磷霉素鈉鹽溶液,然后用陽離子交換樹脂交換5～20 min,濾除樹脂后加活性炭脫色、過濾,無水乙醇析晶,得到磷霉素一鈉、二鈉的混合鹽。此方法減小了其它化學物質的加入,純度高,但低溫反應條件苛刻且樹脂活化處理耗酸量較大,污染環(huán)境[12]。氫氧化鈉法是由左磷右胺鹽與氫氧化鈉反應,通過無水乙醇析晶等過程得到堿性磷霉素鈉,再將定量的堿性磷霉素鈉和有機酸進行結合,得到p H值6.5～8.5的中性磷霉素鈉[13]。作者在此采用左磷右胺鹽與氫氧化鈉反應制備磷霉素鈉,并優(yōu)化了工藝條件。反應方程式如下:

1 實驗

1.1 試劑與儀器

左磷右胺鹽(批號100802),湖北某藥業(yè)有限公司;氫氧化鈉(批號F20091117a,純度96%),國藥集團化學試劑有限公司;甲苯(純度99.5%),天津天大化學試劑廠;蒸餾水,自制。

ZK-82B型電熱真空干燥箱,上海實驗儀器廠有限公司;SZCL-2A型數顯智能控溫磁力攪拌器,鞏義予華儀器有限責任公司;DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵,鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 方法

將一定濃度的氫氧化鈉溶液和一定量的甲苯加入到250 m L三口燒瓶中,攪拌下緩慢加入左磷右胺鹽,反應一定時間后靜置分層,油層為α-苯乙胺的甲苯溶液,水層為磷霉素鈉的水溶液。

油層在46～50℃下減壓(0.095 MPa)蒸出甲苯,剩余澄清的α-苯乙胺回收。水層在無水乙醇中析出磷霉素鈉晶體。

1.3 分析與檢測

用氣相色譜測定α-苯乙胺的收率。以α-苯乙胺的峰面積比為橫坐標(x)、質量比為縱坐標(y)繪制標準曲線,擬合線性方程為:y=0.7265x+0.0027,R2= 0.9996。由質量比和稱取的總質量計算α-苯乙胺收率。

磷霉素鈉采用高效液相色譜檢測和紅外光譜表征[14]。

2 結果與討論

2.1 磷霉素鈉合成工藝條件的優(yōu)化

2.1.1 反應溫度

一般來說,水環(huán)境下的反應溫度過低時不僅分子運動不活潑,且水易結冰阻礙反應;而反應溫度過高時環(huán)氧烷對高溫敏感,易開環(huán),導致二醇物雜質增多。實驗采用3種不同的控溫方式,考察反應溫度對磷霉素鈉合成的影響,結果見表1。

表1 反應溫度對磷霉素鈉合成的影響Tab.1 The effect of reaction temperature on synthesis of FS

由表1可知,提高反應溫度對磷霉素鈉的合成有利。同時,實驗表明:2～3℃反應的析晶產品較少,雜質較多,極易潮解;先2～3℃投料完畢時,水層為白色并含有少許白色晶體,經檢測為原料左磷右胺鹽,后升溫至37～38℃時白色溶液變得澄清,析晶產品在50℃/0.09 MPa下干燥6 h后少量融化,產品中含有部分雜質;37～38℃時投料過程無固體沉淀,固體原料投入即參與反應,產品純度和收率較高,說明相較于低溫,37～38℃下原料溶解度增大,反應速率加快,利于磷霉素鈉生成,且省去了升溫步驟,操作易行。因此,確定最佳反應溫度為37～38℃。

2.1.2 投料時間

原料左磷右胺鹽要求緩慢投入再保溫反應,全部反應完畢后析晶計算收率?？疾焱读蠒r間對磷霉素鈉收率的影響,結果如圖1所示。

圖1 投料時間對磷霉素鈉收率的影響Fig.1 The effect of feeding time on FS yield

由圖1可知,磷霉素鈉收率隨投料時間的延長而上升,在20 min時達到最高;繼續(xù)延長投料時間,收率反而下降。這是由于已生成的磷霉素鈉在強堿性環(huán)境下環(huán)氧烷開環(huán)生成雜質二醇物,使得收率降低。因此,確定最佳投料時間為20 min。

2.1.3 保溫時間

投料完畢要繼續(xù)保溫反應一段時間,二者共同構成制備磷霉素鈉的反應時間。在37～38℃下投料,20 min后考察保溫時間對磷霉素鈉收率的影響,結果見圖2。

圖2 保溫時間對磷霉素鈉收率的影響Fig.2 The effect of warm-keeping time on FS yield

由圖2可知,磷霉素鈉快速生成階段主要是在投料期間,左磷右胺鹽與氫氧化鈉溶液接觸即發(fā)生苯乙胺的游離和中和反應。投料完畢中和反應仍大量進行,至保留40 min時磷霉素鈉生成速率開始下降,保溫80 min后雖仍有磷霉素鈉生成但速率大大降低,繼續(xù)反應耗能較大而收效甚微。因此,確定最佳保溫時間為60 min,總反應時間為80 min。

2.1.4 NaOH濃度

將7.8 g NaOH分別溶于75 m L、50 m L、40 m L、30 m L、25 m L、20 m L水中,配制成濃度(mol·L-1)分別為2.67、4.0、5.0、6.67、8.0、10.0的溶液。分別與0.1 mol FMC反應,均沒有檢測到開環(huán)的磷霉素二醇物,說明在37～38℃的反應溫度下,產物磷霉素鈉未水解開環(huán)為二醇物,NaOH與FMC的反應中堿濃度影響不大。在實際操作中,為創(chuàng)造反應的水環(huán)境,確定NaOH的濃度為5 mol·L-1。

2.1.5 原料配比

反應式中FMC和NaOH的摩爾比(原料配比)理論上為1∶2,為使反應完全,通常FMC略過量?？疾煸吓浔葘α酌顾剽c合成的影響,結果見表2。

表2 原料配比對磷霉素鈉合成的影響Tab.2 The effect of reactant ratio on synthesis of FS

由表2可知,磷霉素鈉在FMC和Na OH摩爾比為1∶1.7時收率最高,FMC過量太多則反應不完全,收率降低。因此,確定最佳原料配比為1∶1.7。

2.2 磷霉素鈉析晶條件的優(yōu)化

2.2.1 析晶溫度

考察析晶溫度對磷霉素鈉析晶情況的影響,結果見圖3。

圖3 析晶溫度對磷霉素鈉質量和純度的影響Fig.3 The effect of crystallization temperature on mass and purity of FS

由圖3可知,隨著析晶溫度的升高,析出磷霉素鈉質量略有下降,而純度逐漸上升;但析晶溫度過高,超過60℃時純度反而下降。這是因為,析晶溫度越低,反應中的雜質越容易伴隨磷霉素鈉析出;隨著析晶溫度的升高,雜質在析晶溶劑乙醇中的溶解度增大,析出減少,磷霉素鈉純度上升;當析晶溫度過高時,乙醇易揮發(fā),同時環(huán)氧烷易開環(huán),副產物增多,磷霉素鈉純度反而下降。文獻[15]報道磷霉素鈉在60～64℃范圍內析晶良好,經驗證,小幅升溫對析晶結果并沒有幫助,因此,確定最佳析晶溫度為60℃。

2.2.2 析晶溶劑用量

乙醇因其廉價易得而在工業(yè)上被用作磷霉素鈉的析晶溶劑,但消耗量很大,且磷霉素鈉極易溶于水,工業(yè)乙醇中水含量較大,需先進行除水。實驗室采用無水乙醇析晶,考察乙醇用量對0.1 mol磷霉素鈉析晶的影響,結果見表3。

表3 乙醇用量對磷霉素鈉析晶的影響Tab.3 The effect of ethanol amount on crystallization of FS

由表3可知,乙醇用量為300 m L時未能得到磷霉素鈉晶體,而乙醇用量為350～450 m L時,析出的磷霉素鈉晶體質量相差不大。實驗發(fā)現,用300 m L無水乙醇析晶,水層滴加先產生白色晶體,隨著水層的加入逐漸析出白色膠體,并將晶體包裹其中,呈凝膠狀,無法抽濾干燥;用350 m L無水乙醇析晶,水層滴加析出白色晶體,繼續(xù)攪拌晶體呈大顆粒狀,盡管析出晶體的量較多但是晶型不夠好;用400 m L無水乙醇析晶,整個析晶過程中始終析出白色粉末狀晶體,為磷霉素鈉優(yōu)質晶型;其后再加大乙醇用量,析晶狀態(tài)不變,磷霉素鈉析出仍然為白色粉末狀晶體。

因此,確定最佳乙醇用量為400 m L,即磷霉素鈉投料量與乙醇用量的比例為1∶4(mol∶L),此時析出的晶體形態(tài)好(為均勻粉末狀),且析晶完全,純度高,符合磷霉素鈉標準。

2.3 紅外光譜分析

磷霉素鈉標準品和產品的紅外光譜見圖4。

圖4 磷霉素鈉標準品和產品的紅外光譜Fig.4 The FTIR spectra of FS standard and product

由圖4可知,產品紅外光譜的各特征峰與磷霉素鈉標準品的相符:3300 cm-1處寬而強的吸收峰為醇類化合物分子間氫鍵O-H伸縮振動吸收峰,1260 cm-1處的8μ峰、941 cm-1處的11μ峰以及846 cm-1處的12μ峰為環(huán)氧烷振動的特征吸收峰,1076 cm-1處為磷酸基團的強吸收峰。表明所制備產品為磷霉素鈉。

2.4 高效液相色譜分析(圖5)

圖5 磷霉素鈉產品的高效液相色譜Fig.5 The HPLC chromatogram of FS product

檢測磷霉素鈉標準品有兩處峰,出峰時間分別為1.978 min和10.722 min,前者為Na+峰,后者為磷霉素峰。由圖5可知,Na+極性強,其峰混在1.990 min處的溶劑峰之中;10.815 min處為磷霉素峰;而8.325 min處小峰則為雜質峰。磷霉素鈉產品純度為產品和標準品中磷霉素峰面積之比。

3 結論

(1)以左磷右胺鹽為起始原料與氫氧化鈉溶液反應制備得到磷霉素鈉,適宜的合成工藝條件為:反應溫度37～38℃、投料時間20 min、保溫時間60 min、氫氧化鈉濃度5 mol·L-1、左磷右胺鹽和氫氧化鈉摩爾比1∶1.7,在此條件下,磷霉素鈉的收率達85.4%。

(2)磷霉素鈉水溶液用無水乙醇析晶,在析晶溫度為60℃、磷霉素鈉投料量與乙醇用量比為1∶4(mol∶L)時可析出晶型良好的磷霉素鈉結晶粉末。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:884.

[2] 王兆文.磷霉素鈉治療菌病的臨床觀察[J].中國社區(qū)醫(yī)師:醫(yī)學專業(yè),2008,10(22):35.

[3] 尹雄章,杜光,孫明輝.磷霉素的作用機制及臨床應用[J].醫(yī)學導報,2011,30(12):1608-1613.

[4] Baylan O.Fosfomycin:Past,present and future[J].Mikrobiyol Bul, 2010,44(2):311-321.

[5] Pakhomova S,Bartlett S G,Augustus A,et al.Crystal structure of fosfomycin resistance kinase Fom A from Streptomyces wedmorensis[J].Journal of Biological Chemistry,2008,283(42):28518-28526.

[6] Kim S Y,Ju K S,Metcalf W W,et al.Different biosynthetic pathways to fosfomycin in Pseudomonas syringae and Streptomyces [J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(8):4175-4183.

[7] Kastoris A C,Rafailidis P I,Vouloumanou E K,et al.Synergy of fosfomycin with other antibiotics for gram-positive and gram-negative bacteria[J].Eur J Clin Pharmacol,2010,66(4):359-368.

[8] Krause R,Patruta S,Daxb?ck F,et al.The effect of fosfomycin on neutrophil function[J].J Am Chem Soc,2001,47(2):141-146.

[9] 張旭東.磷霉素鈉的臨床用藥分析[J].包頭醫(yī)學院學報,2011,27 (2):141-142.

[10] Falagas M E,Giannopoulou K P,Kokolakis G N,等.磷霉素在除尿路及胃腸道以外的感染中的應用[J].中國感染與化療雜志, 2010,(2):103.

[11] Torrengrosa H A,Fernandez I M,Garcia S M,et al.Mixtures of mono-and disodium salts of fosfomycin[P].EP 0 213 704(A2), 1987-03-11.

[12] 趙華,張英.制備中性磷霉素鈉的新方法[P].CN 1 268 628C, 2006-08-09.

[13] 劉春鳳,范寧.一種低成本高純度磷霉素鈉的制備方法[P].CN 101 759 721A,2010-06-30.

[14] 衷紅梅,宋燕玲,楊欣.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定注射用磷霉素鈉含量[J].藥物分析雜志,2006,26(11):1678-1680.

[15] 張慶武.制備注射用磷霉素鈉的新方法[P].CN 101 845 059A, 2010-09-29.

Optimization on Synthesis Technology of Fosfomycin Sodium by Phosphonomycin(R)-1-phenethylamine Salt

HUANG Chen,DING Yi-gang,DU Zhi-ping,HUANG Li-ming,WANG Chao,SHEN Qiong-lu,MENG Qing-lin
(Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education,Hubei Key Laboratory of Novel Reactor&Green Chemical Technology,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430073,China)

With phosphonomycin(R)-1-phenethylamine salt as raw material,fosfomycin sodium(FS)was prepared by reaction with sodium hydroxide.The effects of various factors such as reaction temperature,feeding time,warm-keeping time,concentration of sodium hydroxide and reactant ratio on FS yield were investigated and the crystallization conditions for FS were optimized.The FS yield reached 85.4%under the optimum synthetic conditions as follows:the reaction temperature of 37～38℃,the feeding time of 20 min,the warm-keeping time of 60 min,the concentration of sodium hydroxide of 5 mol·L-1,the molar ratio of phosphonomycin (R)-1-phenethylamine salt to sodium hydroxide was 1∶1.7.Moreover,the FS crystal powder with good crystal type could be obtained by crystallation using anhydrous ethanol at 60℃with the amount ratio of FS to ethanol of 1∶4(mol∶L).

fosfomycin sodium;synthesis;process optimization

TQ 463

A

1672-5425(2013)01-0032-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.01.08

國家自然科學基金重點資助項目(20936003),湖北省自然科學基金重點資助項目(2008CDA009),湖北省教育廳科學技術研究項目(Q20101511),武漢工程大學研究生創(chuàng)新基金項目(CX201108)

2012-10-16

黃晨(1987-),女,湖北荊州人,碩士研究生,主要從事藥物合成研究,E-mail:huangchen0911@163.com;通訊作者:丁一剛,教授,E-mail:dygzhangli@163.com。