張 強(qiáng)，冀 偉，王一東

（長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

纖維質(zhì)原料是地球上最豐富的可再生資源，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成。我國(guó)每年可利用的纖維質(zhì)原料大約在7×108t，主要來(lái)自農(nóng)業(yè)、林業(yè)、工業(yè)以及城市的廢棄物，這些都是酒精生產(chǎn)的豐富原料。 隨著世界能源危機(jī)日趨惡化，利用成本低廉的纖維質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精已經(jīng)引起人們極大的興趣[1]。

盡管纖維質(zhì)原料來(lái)源廣泛、成本廉價(jià)，但將其生物轉(zhuǎn)化成酒精的工藝過(guò)程非常復(fù)雜。目前整體水平尚處于中試階段，主要由于原料預(yù)處理、纖維素酶解、水解物發(fā)酵三大關(guān)鍵技術(shù)尚未取得工業(yè)化突破。有關(guān)纖維質(zhì)原料制取酒精的預(yù)處理技術(shù)、酶解技術(shù)目前論述較多，為纖維質(zhì)原料酒精生產(chǎn)提供了新的研究思路。因此本文主要對(duì)另一關(guān)鍵技術(shù)——利用五碳糖和六碳糖共發(fā)酵生產(chǎn)酒精菌種選育進(jìn)行探討。

纖維素水解主要產(chǎn)物是葡萄糖等六碳糖，而半纖維素水解產(chǎn)物主要是木糖等五碳糖。傳統(tǒng)用于酒精發(fā)酵的微生物，例如釀酒酵母能很容易地利用葡萄糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，但不能利用木糖。充分利用纖維質(zhì)原料中的木糖，可使酒精的產(chǎn)量在原有基礎(chǔ)上增加25%[2-3]。因此選育能共發(fā)酵五碳糖和六碳糖生產(chǎn)酒精的菌株，對(duì)于實(shí)現(xiàn)纖維質(zhì)原料酒精工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。

本文主要介紹了利用自然微生物、重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、重組大腸桿菌以及重組釀酒酵母等進(jìn)行五碳糖和六碳糖酒精發(fā)酵的進(jìn)展情況。

1 自然微生物

過(guò)去人們一直認(rèn)為木糖不能用于酒精發(fā)酵。直到1980年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)菌、酵母菌等可通過(guò)發(fā)酵木糖生產(chǎn)酒精，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一百多種微生物能夠代謝木糖。國(guó)內(nèi)外研究最多的就是酵母菌，主要包括樹(shù)干畢赤酵母（Pichia stipitis）、嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannop hilus）、休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）和產(chǎn)朊假絲酵母等，它們既能夠利用葡萄糖也能利用木糖進(jìn)行酒精發(fā)酵。湯斌等[4]經(jīng)過(guò)篩選獲得一株休哈塔假絲酵母TZ8-13，然后利用木糖和葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)糖濃度為60 g/L時(shí)，酒精產(chǎn)量分別達(dá)到21.6 g/L和24.2 g/L。但人們目前研究最多、最深入且最具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的仍是樹(shù)干畢赤酵母。

Agbogbo等[5]首先采用樹(shù)干畢赤酵母（P.stipitisCBS 6054）對(duì)葡萄糖和木糖混合物（60g/L）進(jìn)行了詳細(xì)酒精發(fā)酵研究，見(jiàn)表 1。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌體對(duì)葡萄糖利用優(yōu)先于木糖，葡萄糖大部分用于細(xì)胞生長(zhǎng)，而木糖主要用于酒精合成。因此雖然葡萄糖的消耗率較高，但酒精得率相對(duì)較低；而木糖雖然消耗率較低，但酒精得率相對(duì)較高。所以從表 1中看到隨著混合物中木糖比例增高，酒精得率也明顯增高。

后來(lái)Agbogob又采用上述菌種作為發(fā)酵菌種，將玉米秸稈經(jīng)過(guò)稀硫酸處理后，利用過(guò)濾后的水解液進(jìn)行酒精發(fā)酵，其中每升水解液中含34 g木糖及8 g葡萄糖，經(jīng)過(guò)72 h發(fā)酵，最高酒精得率達(dá)到了0.44g/g[6]。Ferrari等[7]利用稀硫酸處理的桉木水解液，采用樹(shù)干畢赤酵母（Pichia stipitisNRRLY- 7124.）作為發(fā)酵菌種，在氧傳遞速率 2.4 mmol/ (L·h)，pH值6.5情況下，經(jīng)過(guò)75 h發(fā)酵，酒精得率為0.35g/g。

表1 樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵葡萄糖和木糖混合物發(fā)酵結(jié)果

雖然樹(shù)干畢赤酵母能夠利用五碳糖和六碳糖，但對(duì)酒精和抑制劑耐受度低，導(dǎo)致發(fā)酵液中酒精濃度低，而且發(fā)酵過(guò)程中需要“半好氧”，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。脫毒處理往往會(huì)取得更好的結(jié)果。作者利用濕熱預(yù)處理（195 ℃，15 min）后的玉米秸稈水解液，分別采用中和法、飽和生石灰法和 Na2SO3法去除水解液中的抑制劑，然后利用樹(shù)干畢赤酵母（Pichia stipitis58376）對(duì)脫毒后的水解液進(jìn)行酒精發(fā)酵。結(jié)果表明：樹(shù)干畢赤酵母對(duì)玉米秸稈水解液中抑制劑很敏感，經(jīng)過(guò)3種方法脫毒處理后，酒精得率都得到明顯提高。最佳的脫毒方法是飽和生石灰法，酒精濃度達(dá)到12.2 g/L，理論酒精得率為69.31%[8]。

2 基因工程菌株

2.1 研究思路

目前對(duì)于五碳糖和六碳糖共發(fā)酵生產(chǎn)酒精的菌種研究除了自然微生物外、主要集中在對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等基因改造上。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和釀酒酵母生長(zhǎng)速度快，酒精得率高，但是不能夠利用五碳糖；而大腸桿菌雖然能夠利用六碳糖和五碳糖，但酒精得率低，副產(chǎn)物多，所以研究者往往運(yùn)用基因工程手段來(lái)解決這些微生物五碳糖和六碳糖共發(fā)酵的問(wèn)題[9-11]。目前研究思路主要包括兩點(diǎn)：一是在高效代謝六碳糖的菌種中引入五碳糖代謝途徑；二是向能利用混合糖但酒精得率低的菌種中引入高產(chǎn)酒精關(guān)鍵酶基因，例如來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的兩個(gè)酒精轉(zhuǎn)化重要基因 pdc（丙酮酸脫羧酶基因）及adh（酒精脫氫酶基因）。通過(guò)這兩種方法實(shí)現(xiàn)五碳糖和六碳糖高效酒精發(fā)酵。

2.2 五碳糖和六碳糖代謝途徑

葡萄糖是很容易利用的碳源，許多微生物都能夠利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)酒精。葡萄糖首先經(jīng)過(guò)糖酵解途徑或ED途徑生成丙酮酸，然后丙酮酸在丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶作用下生成酒精。

五碳糖的代謝主要是指木糖的代謝，傳統(tǒng)的釀酒酵母體內(nèi)因缺乏木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶，因而不能利用木糖，但可以利用木糖的異構(gòu)體——木酮糖。自然界中木糖可以通過(guò)兩種途徑轉(zhuǎn)化為木酮糖。在真菌中，木糖在木糖還原酶（xylose reductase）和木糖醇脫氫酶（xylitol dehydrogenase）的共同作用下使木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖；而在細(xì)菌中，則通過(guò)木糖異構(gòu)酶（xylose isomerase）一步轉(zhuǎn)化為木酮糖[7]。木糖能夠轉(zhuǎn)化為木酮糖是實(shí)現(xiàn)木糖酒精發(fā)酵的關(guān)鍵。利用木糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，代謝途徑如圖1所示。木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖后，經(jīng)過(guò)木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，在轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的作用下，5-磷酸木酮糖進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成葡萄糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸，由此進(jìn)入磷酸戊糖途徑（PPP）[12-13]，最終丙酮酸脫羧還原為酒精。

2.3 重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌是目前唯一通過(guò)ED途徑厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物。它擁有高效的將丙酮酸轉(zhuǎn)化成酒精的丙酮酸脫羧酶（pdc）和酒精脫氫酶（adh）酶系統(tǒng)，因此運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長(zhǎng)速度快，酒精得率高，但是不能利用五碳糖[14-16]。因而可以將與五碳糖代謝途徑有關(guān)的酶引入到該細(xì)胞中，從而構(gòu)建重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，使其能代謝利用五碳糖。

這些酶包括木糖異構(gòu)酶xylose isomerase、木酮糖激酶xylulokinase、轉(zhuǎn)醛醇酶transaldolase和轉(zhuǎn)酮醇酶transketolase。

人們?cè)缙趦H僅將木糖異構(gòu)酶基因以及木酮糖激酶基因轉(zhuǎn)入到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，但研究結(jié)果并不理想，主要因?yàn)檗D(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的活性太低，而這兩種酶是五碳糖代謝的關(guān)鍵酶。后來(lái)美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室Zhang等[17]將來(lái)自大腸桿菌的木糖異構(gòu)酶（XI）、木酮糖激酶（XK）、talB（轉(zhuǎn)醛醇酶基因）和tktA（轉(zhuǎn)酮醇酶基因）一同轉(zhuǎn)入到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，得到重組運(yùn)動(dòng)菌株Z.mobilisCP4（pZB5）。然后利用該菌株以木糖（25 g/L）作為唯一碳源進(jìn)行酒精發(fā)酵試驗(yàn)，酒精產(chǎn)率可達(dá)到理論值的86%，而在由木糖和葡萄糖各25 g/L 組成的混合培養(yǎng)基中進(jìn)行酒精發(fā)酵試驗(yàn)，兩種糖的轉(zhuǎn)化率都可以達(dá)到95%。后來(lái)Zhang 等又利用同源重組技術(shù)將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行木糖發(fā)酵所需要的7個(gè)基因進(jìn)行染色體整合，整合菌株在由 4% 葡萄糖和 4%木糖組成的混合培養(yǎng)基中進(jìn)行酒精發(fā)酵試驗(yàn)，酒精產(chǎn)率達(dá)到理論值的83%。這個(gè)結(jié)果與前面重組菌株CP4的酒精得率結(jié)果非常接近，但整合菌株大大增加了外源基因的穩(wěn)定性，酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物也明顯減少。

Chou 等[18]利用磷酸戊糖途徑的7 個(gè)代謝基因構(gòu)建了能同時(shí)發(fā)酵葡萄糖和木糖的基因工程菌株pZB301，對(duì)含葡萄糖30 g/L、木糖30 g/L混合培養(yǎng)基進(jìn)行酒精發(fā)酵試驗(yàn)，酒精的得率達(dá)到理論值的82%～84%。

圖1 五碳糖和六碳糖酒精發(fā)酵途徑

但是以上這些菌種由于木糖代謝基因都存在于質(zhì)粒中，為防止質(zhì)粒的丟失，往往在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素，這也將增加生產(chǎn)成本。

2.4 重組大腸桿菌

大腸桿菌可以利用葡萄糖等六碳糖和木糖等五碳糖進(jìn)行酒精發(fā)酵。由于大腸桿菌的代謝機(jī)制以及糖代謝途徑比較復(fù)雜，體內(nèi)缺乏強(qiáng)有力的酒精發(fā)酵酶系統(tǒng)，酒精只是其代謝產(chǎn)物中很小的一部分。因此對(duì)于大腸桿菌的改造目標(biāo)是增強(qiáng)其產(chǎn)酒精的能力，可采用基因工程手段將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的兩個(gè)酒精轉(zhuǎn)化重要基因pdc及adh克隆到大腸桿菌中，組成PET 操縱子進(jìn)行酒精發(fā)酵。

Ingram等[19]在20世紀(jì)80年代利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的高活力丙酮酸脫羧酶基因和酒精脫氫酶基因構(gòu)建了PET 操縱子（pLOI297），并將該操縱子導(dǎo)入到大腸桿菌中構(gòu)建成基因工程菌，然后利用該工程菌發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)酒精，酒精產(chǎn)量達(dá)到理論值的84%。Escherichia coliK011是帶有PET操縱子的一種染色體整合菌。 其中木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因的表達(dá)水平分別是出發(fā)菌株的3倍多和2倍多，被認(rèn)為是近來(lái)用于發(fā)酵混合糖產(chǎn)酒精的比較理想的菌種之一[20]。Moniruzzaman等[21]采用該菌株對(duì)玉米纖維氨爆破產(chǎn)物進(jìn)行酒精發(fā)酵試驗(yàn)，水解液混合糖含量為47 g/L，最終酒精濃度為21 g/L，酒精得率達(dá)到理論值的98%。但是，在葡萄糖和木糖共存時(shí)，該菌株總是優(yōu)先利用葡萄糖，然后再利用木糖。后來(lái)Yomano等[22]對(duì)KO11的適應(yīng)性進(jìn)行研究，獲得了對(duì)酒精具有較強(qiáng)耐受性的新菌株LY01，利用該菌株對(duì)140 g/L木糖進(jìn)行發(fā)酵，酒精濃度達(dá)到了60 g/L，發(fā)酵時(shí)間也由120 h縮短為96 h，并且對(duì)木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中抑制劑的耐受性遠(yuǎn)高于 KO11。高文等[23]將大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶pfl基因連同運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的pdc和adh基因一同轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌E.coliTOP10-pfl，也能穩(wěn)定地利用葡萄糖和木糖產(chǎn)酒精，從而在大腸桿菌中建立了一條新的代謝糖產(chǎn)酒精的途徑。

2.5 重組釀酒酵母

釀酒酵母是傳統(tǒng)酒精工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)常使用的優(yōu)良菌株，由于體內(nèi)缺乏木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶，因此不能利用木糖，只能利用木酮糖。為解決此問(wèn)題，人們?cè)卺劸平湍阁w內(nèi)引入能夠轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的代謝途徑，使其能夠利用木糖[24-25]。

楊忞等[26]利用休哈塔假絲酵母的木糖還原酶基因 XYL1和熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因XYL2，分別構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒 pACT2-xyl1和pDR195-xyl2，并利用這兩個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建出重組酵母染色體整合質(zhì)粒 YIp5-kanR-x12，希望通過(guò)同源重組技術(shù)將其整合到釀酒酵母中，得到穩(wěn)定代謝葡萄糖和木糖產(chǎn)酒精的重組酵母菌株。葉凱等[27]將木糖還原酶基因xyl1和木糖醇脫氫酶基因xyl2串聯(lián)在一起，導(dǎo)入含組成型GAP的PYES2載體中，構(gòu)建了PYES2-GAP-xyl1-xyl2質(zhì)粒，然后導(dǎo)入到釀酒酵母中，該重組釀酒酵母能高效利用秸稈中纖維素和半纖維素降解的五碳糖和六碳糖，并且申報(bào)了專(zhuān)利技術(shù)。沈煜等[28]將木酮糖激酶基因 （XYL3）克隆到已含有XYL1和XYL2基因的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子中，得到重組釀酒酵母 HSXY-251，與原始菌株相比，木糖醇的產(chǎn)量降低了84.9%，酒精產(chǎn)量提高了36%。另外研究發(fā)現(xiàn)，利用基因工程手段構(gòu)建重組釀酒酵母時(shí)，必須同時(shí)提高轉(zhuǎn)化子的木酮糖激酶（XK）活性。然而由于木糖代謝途徑下游不暢以及氧化還原不平衡等原因，目前重組釀酒酵母的木糖代謝工程還有待進(jìn)一步研究。

2.6 其 它

除了前面介紹的自然微生物、重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和重組大腸桿菌和重組釀酒酵母以外，還有一些其它產(chǎn)酒精細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道。例如克雷白氏菌（Klebsiella oxytocaK），但野生克雷白氏菌的發(fā)酵產(chǎn)物主要為有機(jī)酸，酒精產(chǎn)量較低，對(duì)酒精耐受性也較差，因此對(duì)其進(jìn)行改造難度較大。

3 結(jié) 論

利用纖維質(zhì)原料生產(chǎn)酒精，關(guān)鍵之一就是找到能共發(fā)酵五碳糖和六碳糖的生產(chǎn)菌種。到目前為止，這方面的研究已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，但仍有許多問(wèn)題需要解決。第一，自然微生物普遍存在酒精生產(chǎn)能力低、耐受性較差、副產(chǎn)物多等缺陷；而通過(guò)基因工程手段獲得的重組菌，酒精產(chǎn)率和耐受性仍然偏低。第二，用于改良的菌株多以實(shí)驗(yàn)室菌株為主，改良后的菌株遺傳性狀不穩(wěn)定，活力較差，難以工業(yè)化應(yīng)用。第三，目前研究還有很大的局限性。人們只是對(duì)某個(gè)代謝途徑中單個(gè)基因或者幾個(gè)基因進(jìn)行了改造，也就是只改變了細(xì)胞局部代謝平衡，對(duì)木糖整個(gè)代謝中出現(xiàn)的問(wèn)題并沒(méi)有完全解決，所以結(jié)果并不理想。

從木糖代謝途徑的基因組層面上進(jìn)行定向進(jìn)化或同時(shí)改變多個(gè)相關(guān)基因群，使細(xì)胞代謝從整體上發(fā)生改變，從而適應(yīng)木糖酒精代謝的需求。另外對(duì)重組菌進(jìn)行隨機(jī)突變、進(jìn)化選育并結(jié)合現(xiàn)代高通量篩選等技術(shù)，將是未來(lái)研究工作的重點(diǎn)。

相信隨著基因工程、代謝工程以及蛋白質(zhì)工程等學(xué)科的發(fā)展，全面了解產(chǎn)酒精微生物代謝網(wǎng)絡(luò)的生理功能和調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流、信息流和能量流的分布，將會(huì)推動(dòng)燃料酒精的發(fā)展。

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