何敏超，張 宇，許敬亮，袁振宏

（中國科學院廣州能源研究所，中國科學院可再生能源與天然氣水合物重點實驗室，廣東 廣州 510640）

獲得含高酶活菌株的樣品和采用正確的篩選方法是從自然界篩選到高酶活菌株的兩個重要環(huán)節(jié)。一般而言，包括高酶活菌株在內(nèi)的大多數(shù)微生物都具有較強的適應性，加之不同篩選方法的效果沒有太大差異。因而，從自然界采集含有高酶活菌株就成為獲得高酶活菌株的決定性因素。由于菌株篩選的勞動量通常較大，所以如何快速、高效率地篩選含有高酶活菌株的樣品就成為研究者關注的焦點。只有認識了高酶活菌株在自然界分布的內(nèi)在規(guī)律，才有可能在很大程度上提高菌株篩選的效率。

目前，木聚糖酶研究方面的綜述性文章較多，其中不乏木聚糖酶菌株誘變選育以及基因工程改造方面的文獻。自然誘變的木聚糖酶高產(chǎn)菌株，其發(fā)酵活力一般在10000個國際單位。木聚糖酶基因工程菌的產(chǎn)酶水平可以達到50000個國際單位。盡管自然篩選的菌株絕大多數(shù)不能夠直接用于工業(yè)化生產(chǎn)，但自然篩選的菌株是進行誘變選育和工程菌構建的基礎菌種來源，而且有關木聚糖酶產(chǎn)酶菌株篩選的研究報道并不多見。本文擬對產(chǎn)酶菌株篩選方面的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀做一概括和總結，以期為產(chǎn)木聚糖酶菌株篩選研究提供一些有益的參考。同時，也希望能為木聚糖酶菌株篩選的經(jīng)驗交流提供有價值的信息。

1 不同酶活梯度與采樣點的關系

為了更好地區(qū)別不同來源的樣品對最終篩選菌株所造成的影響，特將酶活分成不同的梯度進行歸納和整理。

1.1 酶活在5～99個國際單位酶活的菌株與其采樣點的關系

在表1中，文獻中的樣品來源于土樣，但這些表述無法具體說明該樣品的特征，比如：是否含有木質(zhì)纖維素？木質(zhì)纖維素是否豐富？木質(zhì)纖維素的腐爛程度？該樣品是枯葉遮蔽下的土樣還是表層樣？是挖取多深的土樣？詳盡地描述采樣地點的確切信息，能夠為產(chǎn)酶菌株的篩選提供詳細參考。表1中的樣品來源只能為木聚糖酶菌株篩選提供一些大致的參考。

在篩選出來的微生物類別中，6篇文章中產(chǎn)酶菌株為細菌類。而僅有1篇文章的產(chǎn)酶菌株為真菌類。該表中的細菌不僅僅分布在造紙廠的堿性土壤，還分布于堆肥、飼料堆積物、甘蔗根部泥土和北京城區(qū)。有趣的是，可以在北京城區(qū)篩選到酶活達84.97個國際單位的放線菌，而在高峰林場篩選到的菌株居然不到10個國際單位。由此可見，大城市中采集的樣品未必沒有某些原始森林的樣品好。

1.2 酶活在 101～500國際單位的菌株與其采樣點的關系

表2中，5篇文獻的樣品來源均是土樣。表2與表1的樣品來源差別是，這個表格中的文獻資料比較詳細地說明了土樣的一種特征，即富含木質(zhì)纖維素。在篩選酶活達到249.2個國際單位，優(yōu)化酶活為623個國際單位的卷須鏈霉菌這篇文獻中，如果能夠更加詳細地描述說明該菌株是采自玉米芯堆積物、糖化糟堆積處、原始森林或農(nóng)家堆肥的取樣地點，則會為高酶活菌株分布的特征提供更有價值的參考。

在篩選出來的微生物類別中，5篇文獻中的產(chǎn)酶菌皆為細菌類，因為無論是鏈霉菌還是卷須鏈霉菌都歸屬于放線菌目，而放線菌隸屬于細菌類。然而，當前的木聚糖酶工業(yè)化菌株多為真菌，如畢赤酵母和黑曲霉。

1.3 酶活在501～1000個國際單位的菌株與其采樣點的關系

表3中，7篇文獻中的樣品來源均是土樣。除青海鹽堿湖和天山這兩個比較偏遠的地方之外，垃圾場、江西農(nóng)業(yè)大學附近的堆積物和富含腐敗木質(zhì)纖維的土樣都是采樣較便捷的地方。這也從一定程度上說明采集較高酶活的樣品，或許可從人們生活環(huán)境周圍的污物堆放處獲得。

表1 5～99個國際單位酶活菌株

表2 101～500個國際單位酶活菌株

表3 501～1000個國際單位酶活菌株

表4 1001～4000個國際單位酶活菌株

在篩選出來的微生物類別中，6篇文獻中有 4篇的產(chǎn)酶菌為細菌類，2篇為黑曲霉。

1.4 酶活在1001～4000國際單位的菌株與其采樣點的關系

表4中，4篇文獻中有2篇的產(chǎn)酶菌為細菌類，2篇為黑曲霉。由表3和表4可以看出來，黑曲霉通常分布在距離人們生活范圍較近的地方。

將表4和表3結合起來看，酶活較高的菌株不一定就分布在人跡罕至的原始森林或者人煙稀少的邊疆地帶，而是可能分布在便于采集的地方。除了便于采集的特點外，值得注意的一點是：無論是鄭州市的森林公園，或者是江西農(nóng)業(yè)大學附近的各種堆（積谷殼堆、稻草堆），或者是大學（江西農(nóng)業(yè)大學、廣西大學）的農(nóng)場稻田，其地勢均較為平坦。

本文作者從600多個樣品中篩選到4株篩選酶活超過500個國際單位的菌株，此4菌的樣品均采自地勢較為平坦的地帶，而從地勢較陡的地點采集的樣品，其酶活都較低。另外，作者在神農(nóng)架采集到的300多份樣品中，一株高酶活的菌株也沒有篩選到，而這300多份樣品都采自地勢都較為陡峭的坡地或者溝底。

1.5 4001～10000國際單位酶活的菌株與其采樣點的關系

王洪媛等[23]篩選到1株青霉菌，發(fā)酵優(yōu)化活力為4236個國際單位。叢倩千等[24]篩選到1株毛殼霉菌，其優(yōu)化活力為4897個國際單位。美中不足的是這兩個菌株的具體采樣環(huán)境和樣品特性無從得知。如果能夠具體的說明該菌株的來源，該論文將會為高酶活菌株分布規(guī)律提供有價值的信息。江正強 等[25]從新疆篩選到Thermomyces lanuginosusCAU44，其發(fā)酵酶活高達4156個國際單位。

Bindu 等[26-27]篩選到1株枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵酶活在不同的發(fā)酵條件下，酶活為 5407～7087個國際單位。有趣的是，Michele等[28]從樹干表面篩選到1株棲土曲霉，其發(fā)酵酶活達到7475個國際單位。Ashwani等[29]從其所在的當?shù)赝寥乐泻Y選到Bacillus subtilisASH，酶活為8964個國際單位。

1.6 活力在10001國際單位以上的菌株與其采樣點的關系

江正強等[30]利用1株鏈霉菌進行發(fā)酵優(yōu)化，酶活高達18580個國際單位。該菌株由江正強所在的課題組采自新疆天池附近的土樣。Manimaran等[31]從印度尼西亞和不列顛群島的空氣中篩選到Thermomyces lanuginosusSSBP，其酶活高達19320個國際單位。Asha等[32]從林中土壤中篩選到1株枯草芽孢桿菌，其酶活高達35156個國際單位。Sonia等[33]從堆肥中篩選到T.lanuginosusD2W3，其酶活為48 000 ± 1774個國際單位。Nagar等[34]從土壤中篩選到1株芽孢桿菌Bacillus pumilusSV-85S，優(yōu)化后酶活高達73000個國際單位，是未優(yōu)化時的 13倍。

可以看出，酶活超過10000個國際單位的菌株大多數(shù)為芽孢桿菌。我國目前應用于造紙行業(yè)的堿性木聚糖酶主要是芽孢類細菌。另外，我國傳統(tǒng)的高溫淀粉酶菌株和堿性蛋白酶菌株也都是芽孢類細菌。因此，篩選細菌類木聚糖酶產(chǎn)酶菌株，對于發(fā)現(xiàn)高酶活的木聚糖酶產(chǎn)酶菌株具有非常重要的意義。

1.7 產(chǎn)酶菌株的篩選

從自然界篩選的產(chǎn)酶菌株，其發(fā)酵復篩酶活絕大多數(shù)在500個國際單位以下，產(chǎn)酶較高的菌株，其發(fā)酵復篩酶活則在500～1000個國際單位，個別的可以達到1164.2個國際單位。

將復篩酶活極高的菌株進行發(fā)酵優(yōu)化后，酶活可以達到623～4897個國際單位，甚至上萬個國際單位。江正強等[30]將鏈霉菌發(fā)酵優(yōu)化后，酶活高達18580個國際單位。Nagar所篩選的菌株，酶活高達73000個國際單位。在不經(jīng)誘變和工程菌構建的情況下，完全達到了工業(yè)發(fā)酵應用的水平。這個最高的發(fā)酵水平與劉喚明等[35]應用離子誘變選育菌株的最高發(fā)酵水平52500個國際單位和基因工程菌的73400個國際單位[36]已經(jīng)持平。由此可見，從自然界篩選的超高酶活菌株不一定比實際應用的工業(yè)化菌株的酶活低。

2 不同種類菌株的優(yōu)化篩選

截止目前為止，研究人員從富含木聚糖的環(huán)境中篩選到各種各樣產(chǎn)木聚糖酶的微生物，并對其發(fā)酵活力進行優(yōu)化，以有效降低木聚糖酶的應用成本。

2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株分類

目前，從自然界篩選到的木聚糖酶菌株，基本上歸屬于真菌或者細菌。能夠產(chǎn)木聚糖酶的真菌種類極其繁多，而細菌則相對較少。另外，作者研究發(fā)現(xiàn)，某些產(chǎn)木聚糖酶的真菌可以生長在pH值為8.5的分離平板上，而某些細菌類的產(chǎn)酶菌株可以生長在pH值為5.6的分離平板上。

2.1.1 產(chǎn)木聚糖酶的真菌分類

能夠產(chǎn)木聚糖酶的真菌主要有：曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、殼霉屬（Chaetomium）、和鐮刀菌屬（Fusarium）等[37-39]。當前，工業(yè)化的木聚糖酶菌株多集中在曲霉屬和木霉屬，如黑曲霉、里氏木霉和長柄木霉等。另外，青霉屬和鐮刀菌屬的木聚糖酶在具有極高纖維素酶的情況下，這兩個屬的菌株也具有較高的木聚糖酶活力[40]。

（1）曲霉屬（Aspergillus）曲霉屬歸類于半知菌類的叢梗孢目、曲霉菌科。曲霉屬能夠產(chǎn)木聚糖酶的種類極多，總種類超過15種。曲霉屬中以黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的性能最佳。該屬的微生物種類主要有：棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）、泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、費舍爾曲霉（Aspergillus fischeri）、臭曲霉（Aspergillu foetidus）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、白曲霉（Aspergillus kawachii）、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、醬油曲霉（Aspergillus sojae）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、土曲霉（Aspergillus terreus）、棲土曲霉（Aspergillus terrestris）、焦曲霉（Aspergillus ustus）、雜色曲霉（Aspergillus versicolor）、溫特曲霉（Aspergillus wentii）及黑曲霉（Aspergillus niger）。

（2）木霉屬（Trichoderma）木霉含有多種酶系，尤其是纖維素酶含量很高，是生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株，與此同時，木霉屬也能夠分泌木聚糖酶。因為自然界的植物性多糖主要為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。該屬的微生物種類主要有：里氏木霉（Trichoderma reesei）、長柄木霉（Trichoderma longibrachiatum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、康寧木霉（Trichoderma koningii）。

（3）青霉屬（Penicillium）青霉屬為半知菌類，在自然界中分布極為廣泛，種類很多。該屬的微生物種類主要有：巴西青霉（Penicillium brasilianum）、膠囊青霉（Penicillium capsulatum）、繩狀青霉（Penicillium funiculosum）、微紫青霉（Penicillium janthinellum）、克羅氏青霉（Penicillium kloeckeri）、嗜松青霉（Penicillium pinophilum）、產(chǎn)紫青霉（Penicillium purpurogenum）。

（4）殼霉屬（Chaetomium）該屬的微生物種類主要有：解纖維毛殼菌（Chaetomium cellulolyticum）和球毛殼霉Chaetomium globosum。

（5）鐮刀菌屬（Fusarium）該屬的種類為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。尖胞鐮刀菌在分泌纖維素酶時，也分泌木聚糖酶。

2.1.2 細菌和酵母菌

能夠產(chǎn)木聚糖酶的細菌主要有：短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、放線菌中的鏈霉菌。能夠產(chǎn)木聚糖酶的酵母也有報道，但因其酶活極低而沒有應用研究的價值。

2.2 不同種類木聚糖酶菌株發(fā)酵優(yōu)化

從自然界篩選到優(yōu)良的菌株后，研究者往往通過發(fā)酵優(yōu)化進一步提高木聚糖酶的發(fā)酵活性。優(yōu)化后最終的發(fā)酵酶活主要取決于3個因素：菌株自身的生理特性、菌株對發(fā)酵環(huán)境（培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件及發(fā)酵方式）的適應能力和優(yōu)化實驗設計的正確性及有效性。一般而言，發(fā)酵后的酶活會提高百分之幾十到幾十倍，酶活會由原來的幾百個國際單位提高到幾千個國際單位，或者由幾千個國際單位提高到上萬個國際單位。

微生物發(fā)酵方式分為液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種方式。目前，工業(yè)化的木聚糖酶絕大多數(shù)都采用液態(tài)發(fā)酵進行生產(chǎn)，而實驗室的研究則大多數(shù)采用固態(tài)發(fā)酵。無論是細菌還是真菌，都可以既進行液態(tài)發(fā)酵，也都可以進行固態(tài)發(fā)酵。

2.2.1 真菌的固態(tài)發(fā)酵

Sonia等[33]采用Thermomyces lanuginosus（D2W3）進行固態(tài)發(fā)酵，在分別利用高粱稈、玉米芯、小麥秸稈、麩皮、稻草秸稈進行發(fā)酵時，木聚糖酶的酶活分別是 10145±141IU/g、2480±87 IU/g、2191±72 IU/g、1901±25 IU/g、1501±19 IU/g。然后分別以不同粒徑的高粱粉進行優(yōu)化，粒徑在2.0～3.0 mm時的酶活為26121 IU/g，粒徑在0.5～1.0時酶活接近19000 IU/g，而粒徑在5.0～7.0時，酶活接近16000 IU/g。最后利用響應面優(yōu)化后，酶活達到48000±1774 IU/g。

非常有趣的是， Senthilkumar 等[41]利用曲霉真菌Aspergillus fi scheri進行固態(tài)發(fā)酵，在初始pH值為9.0的情況下，利用麩皮為碳源，最佳的酶活為1024 IU/g。

2.2.2 真菌的的液態(tài)發(fā)酵

江正強等[25]利用篩選到的Thermomyces lanuginosusCAU44進行發(fā)酵優(yōu)化，在分別利用玉米芯提取的木聚糖、燕麥木聚糖、玉米芯粉、山毛櫸木聚糖和樺木木聚糖進行最佳碳源選擇時，發(fā)酵酶活分別是 3260±128 IU/mL、2385±116 IU/ mL、2156±68 IU/ mL、2147±90 IU/ mL 和 1620±72 IU/mL。利用玉米芯提取的木聚糖發(fā)酵酶活最高，發(fā)酵酶活最低的是樺木木聚糖。相比較含木聚糖純度較高的提取木聚糖而言，在利用成分較為復雜的麩皮、稻草稈、蔗渣、小麥秸稈和稻谷殼進行發(fā)酵優(yōu)化時，其酶活最高的僅僅160 IU/ mL。他們進一步對玉米芯粉含量、玉米芯粉粒徑進行優(yōu)化后，木聚糖酶酶活高達4156 IU/ mL。

2.2.3 細菌的固態(tài)發(fā)酵

Nagar等[34]利用Bacillus pumilusSV-85S進行固態(tài)發(fā)酵，在以麩皮為碳源，接種量為15%、料水比為 1∶3、30 ℃時發(fā)酵 48 h，木聚糖酶的酶活為73000±1000 IU/g，是未優(yōu)化酶活的13.8倍，比未優(yōu)化酶活5300 IU/g高出約68000 IU/g。其實驗數(shù)據(jù)表明，當以麩皮為碳源時，木聚糖酶的酶活高于以稻谷殼、麥秸、稻秸、鋸末、甘蔗渣、堅果殼粉、玉米芯、高粱稈和豆油餅等碳源。該酶的酶學特性為：最佳pH值6.0、溫度50 ℃。

Bindu等[27]以Bacillus pumilusASH進行發(fā)酵優(yōu)化，該菌最佳的碳源為麩皮，最佳接種量為15%，最佳發(fā)酵時間為72 h，最佳料水比為1∶2.5，最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。優(yōu)化后，木聚糖酶酶活由5300 U/g提高到7087 U/g。

絕大多數(shù)的資料顯示，細菌的最佳碳源是麩皮。最佳接種量是15%，最佳料水比為1∶1～1∶3，而大多數(shù)的細菌，其最佳料水比為1∶2.5[34]，發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.2.4 細菌的液態(tài)發(fā)酵

Bindu等[26]以一株Bacillus pumilus為發(fā)酵菌株，首先從諸多發(fā)酵碳源中選出最優(yōu)的碳源為麩皮，然后確定出最佳的麩皮濃度為 2%。接著確定最佳的氮源及氮源濃度。該菌株最佳的初始pH值為8.0、溫度為37 ℃。發(fā)酵酶活提高到5407 IU/mL，是原來酶活的 13倍。同一個菌，最優(yōu)的液態(tài)發(fā)酵酶活一般要比最優(yōu)的固態(tài)發(fā)酵酶活低。如Bindu以同一個菌進行發(fā)酵優(yōu)化，液態(tài)為5407 IU/mL，而固態(tài)為7087 U/g。

對于木聚糖酶產(chǎn)酶菌株而言，有的菌最佳的碳源是麩皮、有的是玉米芯、有的是麩皮和玉米芯的混合物、甚至有的是高粱粉，這主要歸因于不同的菌的生理特性及不同碳源的生物可利用性。值得注意的是，最佳碳源的酶活往往遠高于非最佳碳源的酶活[25,33]，如Thermomyces lanuginosus（D2W3）在利用高粱桿進行發(fā)酵時，其酶活為10145±141IU/g，而利用稻草進行發(fā)酵時，其酶活為1501±19 IU/g，酶活差異達到了8766 IU/g個國際單位。因此，最佳碳源的正確選擇對于最終的發(fā)酵優(yōu)化工藝具有極大的影響作用。

3 展 望

目前的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)高酶活菌株是從富含木質(zhì)纖維素的土壤中篩選到的。因此，在篩選高酶活木聚糖酶產(chǎn)酶菌株時，可以有針對性的選擇一些木質(zhì)纖維類資源豐富的地區(qū)，比如常年堆放枯枝爛葉的平坦地貌。同時，作為獲得有價值菌株的有效手段，可以采用基因工程手段，對從自然界篩選到的菌株進行有目的的定向改造，以獲得更適合工業(yè)化應用的耐逆、抗性及高酶活菌株。

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