陳云超，劉倩芬，黃贛輝

(南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330047)

Englyst等人［1］根據(jù)淀粉消化時間的不同，將淀粉分為快速消化淀粉(RDS)，慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)。前者消化速度最快，并在小腸中吸收;抗性淀粉在小腸中不被消化或緩慢消化，慢消化淀粉的消化速度介于兩者之間?？剐缘矸蹜糜谏攀晨梢悦黠@延緩餐后血糖水平的上升，這一特殊的生理功能可用于糖尿病的預防和膳食治療［2］。抗性淀粉的營養(yǎng)價值及對血糖調(diào)節(jié)的作用往往與其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)有關(guān)系［3］。因此，研究其在消化過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化有助于評價生理學價值。淀粉糊化后喪失原有的顆粒結(jié)構(gòu)和結(jié)晶秩序，在老化回生過程中直鏈淀粉重新聚集使得結(jié)構(gòu)更加緊密。一般認為，抗性淀粉能比較完整的通過小腸進入大腸。但在體外模擬消化的過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)糊化、老化后的淀粉在水解過程中，同時存在著一個老化的進程［4］。直鏈淀粉之間通過氫鍵締合，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而阻礙消化過程的進行［5－6］。因此，研究消化過程中消化物結(jié)構(gòu)的變化，應考慮水解動力學和直鏈淀粉凝沉動力學。抗性淀粉在體內(nèi)消化的機理很復雜，本文采用體外模擬淀粉酶水解原淀粉和增抗淀粉的方法，得到淀粉消化率、消化速率常數(shù)等動力學參數(shù)，并采用X－射線衍射(XRD)、差示掃描量熱(DSC)、傅里葉紅外變換(FT－IR)等對增抗淀粉不同時間段消化產(chǎn)物進行分析，了解消化過程中抗性淀粉結(jié)晶區(qū)發(fā)生的變化，為評價抗性淀粉的消化性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售玉米淀粉 吉林四平;普魯蘭酶 江蘇銳陽生物技術(shù)有限公司;中溫α－淀粉酶 諾維信公司;豬胰α－淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶 Sigma公司;葡萄糖標準品 上海源葉生物科技有限公司;DNS試劑 自行配制;其他試劑或藥品 均為分析純。

HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東光學儀器廠;THZ－82型恒溫水浴振蕩器 金壇市精達儀器制造廠;JT2003型電子分析天平 余姚金諾天平儀器有限公司;722N分光光度計、pH計 上海精密科學儀器廠;SHZ－Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;0421型臺式離心機 上海手術(shù)器械廠;PHS－3C型;BCD－195KA DZ冷藏冷凍冰箱 青島海爾股份有限公司;DHG－9070型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司;DI SYSTEM多功能X－射線衍射儀 英國Bede公司;PYRIS DIAMOND差示掃描量熱儀 美國P.E.公司;Nicolet5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國熱電尼高力公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RS樣品制備［7］取定量的淀粉配成體積分數(shù)8%的懸浮液，在95℃下糊化30min后冷卻至室溫，用檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH為5，在60℃條件下加入定量的普魯蘭酶，恒溫水浴1h后置于沸水浴中滅酶5min。自然冷卻1h，加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH為4，沸水浴30min，冷卻，在4℃條件下冷藏12h，取出糊化15min后自然冷卻，置于－20℃條件下冷凍24h，取出后抽濾，并在60℃條件下干燥，得到增抗玉米淀粉成品，并測定RS含量。

1.2.2 酶對淀粉 In－Vitro消化模擬［8］準確稱取0.2g(精確到0.001g)增抗淀粉于50mL離心管中，加入30mL pH為5.2的0.2mol/L乙酸－乙酸鈉緩沖液(含0.02%的疊氮鈉)，在 37℃條件下水浴振蕩(170r/min)5min后加入10mL豬胰 α－淀粉酶(220U/mL)和淀粉葡萄糖苷酶(12U/mL)的混合液(2∶1)，分別水浴振蕩 0.5、2、4、8、18h。加入 95% 的乙醇終止消化，在2000r/min的條件下離心10min，棄去上清液，沉淀先用0.2mol/L的乙酸－乙酸鈉緩沖液沖洗，再用蒸餾水沖洗一次。在60℃條件下干燥12h。

1.2.3 消化動力學模擬

1.2.3.1 標準曲線的制作 準確稱取100mg葡萄糖，用少量蒸餾水溶解后定容于100mL容量瓶中。分別移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL 的標準葡萄糖溶液于50mL的比色管中，加入蒸餾水定容于2mL，然后分別加入3.0mL DNS試劑，搖勻，于沸水浴中加熱5min，冷卻后加蒸餾水定容于40mL，混勻后于540nm波長處測定吸光度，平行3次，取平均值。

1.2.3.2 淀粉體外消化模型的建立 取200mg玉米淀粉與增抗玉米淀粉分別進行體外消化，分別測定10、20、30、60、90、120、150、180、210、240min 還原糖的釋放量，每次移取0.2mL反應液并停止反應，采用3，5－二硝基水楊酸法(DNS法)測定還原糖含量并計算水解率。

式中，G為水解后產(chǎn)生的葡萄糖含量(mg);0.9為淀粉水解葡萄糖的轉(zhuǎn)化系數(shù);分子中200為稀釋倍數(shù);分母中200為淀粉的重量(mg)。

根據(jù) K Mahasukhonthachat［9］法預測消化動力學模型，利用Origin8.0對數(shù)據(jù)進行擬合。公式如下:

式中，Dt為t時間淀粉的消化率(g/100g淀粉);D0為t=0淀粉的消化率，即D0=0;D∞為t=∞時淀粉的消化率即水解平衡時的濃度(g/100g淀粉);K為水解速率常數(shù)(h－1)。

為了更加了解淀粉的消化情況，引入AUC(t1到t2時間段淀粉消化水解及血糖生成的曲線下的總面積)，如下所示:

1.2.4 X射線衍射與結(jié)晶度的測定 將樣品研磨，過200目篩。采用X射線衍射儀測定樣品的X射線衍射圖譜。測試條件，起始角:4°;終止角:40°;步長:0.02;掃描速度10°/min;積分時間:0.2min;靶型:Cu;管壓管流:40kV，40mA;狹縫:DS=1°，SS=1°，RS=0.3mm;濾波片:sm。采用Jade6.0軟件擬合計算淀粉的結(jié)晶度。

1.2.5 DSC分析 采用差示掃描量熱儀測定淀粉的熱特性。測試條件:掃描溫度30～230℃，掃描速率10℃/min。以空坩堝作為參比，載氣為氮氣，流速30mL/min。

1.2.6 消化物紅外光譜結(jié)構(gòu)分析 采用傅立葉變換紅外光譜儀(FT－IR)記錄干燥淀粉KBr壓片的吸收峰。紅外光譜儀的波長寬度設定為400～4000cm－1。分析前，樣品需在105℃條件下干燥12h以避免樣品中少量水分的影響。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 各組實驗重復三次，記錄數(shù)據(jù)，使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 消化動力學模型的建立

根據(jù)AACC Method 32－40.01法測得原淀粉RS含量為3.6%，增抗玉米淀粉中RS含量為14.72%。如圖2所示，原淀粉和增抗淀粉在0～2h內(nèi)水解速度較快，但原淀粉速度明顯快于增抗淀粉，這是由于玉米原淀粉屬于A型淀粉，其顆粒表面存在許多天然的孔洞［9］，淀粉酶可以直接進入顆粒內(nèi)部并快速作用。而增抗淀粉結(jié)構(gòu)緊密，淀粉酶只能在顆粒表面水解。原淀粉在2h后水解緩慢，釋放非常少的還原糖。2～4h消化率從91.17%變?yōu)?2.87%，而增抗淀粉消化率從71.64%變?yōu)?1.91%。表1列出了兩者消化動力學的相關(guān)參數(shù)，原淀粉的消化速率常數(shù)為2.32(R2=0.990)，遠遠高于增抗淀粉的1.13(R2=0.992)，表明淀粉在增抗后消化性能大大減少。

圖2 淀粉水解預測動力學模型及葡萄糖釋放量Fig.2 The predicted model of hydrolysis kinetics and glucose release

根據(jù)預測的模型可知，玉米原淀粉的平衡水解率能達到92.1%，增抗淀粉為82.2%。但是將兩者不同時間段AUC進行比較可以發(fā)現(xiàn)，2h后原淀粉基本不釋放還原糖。整個消化動力學可以這樣描述:豬胰α－淀粉酶是內(nèi)切酶，在反應的開始階段能無規(guī)則地水解淀粉分子中的α－1，4糖苷鍵，帶有非還原性末端的片段不斷被釋放，為淀粉葡萄糖苷酶提供著大量的底物，淀粉葡萄糖苷酶水解生成葡萄糖，此時葡萄糖的生成速率急劇增加，但是隨著消化時間的延長，淀粉被水解成小分子鏈，淀粉糖苷酶的結(jié)合位點減少，所以反應速率減慢。增抗淀粉在經(jīng)過折疊、卷曲后形成了堅實的結(jié)構(gòu)，前2h，淀粉酶很難接觸到結(jié)晶區(qū)，此時主要作用于無定形區(qū)間，與原淀粉相比，淀粉葡萄糖苷酶獲得的消化底物較少。2h后，雖然結(jié)晶區(qū)被降解，但是生成的短鏈直鏈淀粉互相聚集，阻礙了淀粉葡萄糖苷酶水解。因此，增抗淀粉在后期水解緩慢并逐漸趨于平衡。

表1 動力學模型相關(guān)參數(shù)Table1 The relevant parameter of kinetics

2.3 消化物結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化

一般認為，淀粉顆粒的無定型區(qū)分子鏈結(jié)合松散，酶水解作用在無定型區(qū)。而直鏈淀粉重排后的結(jié)晶區(qū)結(jié)合更加緊密，因而短時間內(nèi)并不易被水解。如圖3所示，未經(jīng)酶處理的增抗淀粉在15.0、16.9、19.6、22.0、23.7°處出現(xiàn)了主要的衍射峰，屬典型的B型淀粉。但隨著消化時間的延長，對應的衍射峰強度不斷發(fā)生變化。結(jié)晶度的變化如表2所示。前2h內(nèi)結(jié)晶度不斷增加，是由于RDS快速水解，RS的比例增加，各衍射峰強度都小幅增加。根據(jù)Englyst定義，2h內(nèi)RDS和SDS完全水解，對應的各衍射峰的強度都不再增加。隨著反應的進行，酶作用于結(jié)晶區(qū)，2～4h內(nèi)結(jié)晶度從38.82%下降至30.20%。此時直鏈淀粉水解成聚合度更小的直鏈淀粉或低聚糖，部分被淀粉葡萄糖苷酶水解成單糖，短時間內(nèi)衍射峰峰強下降。然而，短直鏈淀粉不斷增加，聚合形成結(jié)構(gòu)緊密的抗消化淀粉，觀察18h后消化物的衍射圖可發(fā)現(xiàn)，在衍射峰強度要高于4和8h，且在13.7°左右出現(xiàn)了一個新的衍射峰，是V型淀粉的特征峰，進一步證明了2h后直鏈淀粉重排的發(fā)生。這段時間，結(jié)晶度從4h的30.20%上升至34.9%。

圖3 抗性淀粉各時間段消化物的X－射線衍射圖Fig.3 The XRD diagram of resistant starch at different times of digestion

2.4 消化物熱特性的變化

淀粉的相變吸熱焓代表在相變過程中聚集態(tài)的解聚和熔融時所需要的能量，淀粉相轉(zhuǎn)變溫度取決于結(jié)晶層直鏈淀粉含量、無定型區(qū)的穩(wěn)定性和結(jié)晶聚合物的穩(wěn)定性等。聚合物結(jié)晶度的大小正比于結(jié)晶熔融時的熔融熱ΔH。在0～2h時間段內(nèi)，RDS和SDS不斷水解，RS比例增加，而RS結(jié)構(gòu)比較緊密，熔融時需要的能量大，T0、ΔH有規(guī)律的升高，結(jié)果如圖4、表2所示。2h后由于結(jié)晶區(qū)被水解，結(jié)晶度降低，參照消化動力學模型可知，此時只有少量的葡萄糖釋放，水解動力學已經(jīng)趨于穩(wěn)定。由于結(jié)晶區(qū)存在短鏈直鏈淀粉，結(jié)構(gòu)松散，起始糊化溫度T0降低。4h后，由于短鏈直鏈淀粉不斷聚集堆疊，結(jié)晶度增加，此階段老化動力學大于水解動力學，直鏈淀粉分子間通過氫鍵形成雙螺旋，雙螺旋可以通過氫鍵堆積形成結(jié)晶。但是這種形成的結(jié)晶結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，因此相變時T0、ΔH并沒有隨結(jié)晶度的增加而增加。

圖4 抗性淀粉各時間段消化物的DSC曲線Fig.4 The DSC diagram of resistant starch at different times of digestion

2.5 消化物短程結(jié)構(gòu)的變化

紅外光譜技術(shù)可以用于監(jiān)測消化過程中老化回生淀粉分子序列的變化，1047cm－1附近吸收峰為淀粉結(jié)晶區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，對應的是淀粉聚集態(tài)結(jié)構(gòu)中的有序結(jié)構(gòu);1022cm－1附近的吸收峰則是淀粉無定形區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，對應的是無規(guī)則線團的結(jié)構(gòu);995cm－1附近的吸收峰則對應淀粉分子羥基間所形成的氫鍵結(jié)構(gòu)。淀粉在1047、1022cm－1的紅外吸收的比值表示其分子結(jié)構(gòu)中有序化結(jié)構(gòu)和無序化結(jié)構(gòu)的比例關(guān)系，比例越大，結(jié)晶區(qū)域越多。如圖5所示為不同時間段抗性淀粉消化物在800～1200cm－1間的紅外吸收譜圖，通過計算R1047/1022，可以比較增抗玉米淀粉在酶處理前后結(jié)晶程度的相對大小，如表2所示，前2h結(jié)晶區(qū)的結(jié)構(gòu)特征逐漸增強，非晶區(qū)的結(jié)構(gòu)特征逐漸減弱，2h后呈現(xiàn)無規(guī)律的變化，其規(guī)律與XRD測得的結(jié)晶度的變化一致。紅外光譜測量得到的結(jié)晶度是一種短程的序列，即分子內(nèi)的排列次序，而XRD測量的為分子間的次序，紅外光譜能檢測出結(jié)晶區(qū)重復的單元。

表2 抗性淀粉消化物結(jié)晶度、熱力學參數(shù)、紅外吸收強度比值Table2 The crystallinity，thermodynamic parameter，ratio of Infrared absorption strength of resistant starch at different times of digestion

圖5 抗性淀粉各時間段消化物的紅外光譜圖Fig.5 The FT－IR spectrum of resistant starch at different times of digestion

3 結(jié)論

對玉米淀粉和增抗玉米淀粉進行了體外消化模擬，并建立了一階動力學模型。使用origin8.0擬合，得到原淀粉平衡水解率為92.1%，增抗淀粉為82.2%，消化速率常數(shù)分別為2.32和1.13h－1。原淀粉在2h后基本不釋放還原糖，而增抗淀粉緩慢水解。通過對增抗淀粉消化物的X－射線衍射、DSC、FT－IR分析可知，結(jié)晶度前2h從30.90%增加到38.82%，2h后減少但變化無規(guī)律，焓值和R1047/1022的變化規(guī)律和結(jié)晶度基本相同。結(jié)合增抗淀粉的消化過程進行分析，前2h進行的是以水解動力學為主的消化過程。2h后，淀粉酶水解的短直鏈淀粉之間聚集凝沉，處于一個老化動力學過程，形成的聚合物同樣不被消化，該過程不斷生成另一種“抗性淀粉”。整個消化過程可以理解為水解動力學和老化動力學的競爭過程。

［1］Englyst H N，Kingman S M，CummingsJ H.Classification and measurement of nutritionally important starch fractions［J］.European Journal of Clinical Nutrition，1992，46(12):33－50.

［2］Woo K Kim，Mi K Chung，Nam E Kang，et al.Effect of resistant starch from corn or rice on glucose control，colonic events，and blood lipid concentrations in streptozotocin－ induced diabetic rats［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2003，14:166－172.

［3］王竹，楊月欣，周瑞華，等.抗性淀粉的代謝及對血糖的調(diào)節(jié)作用［J］.營養(yǎng)學報，2003，25(02):190－195.

［4］Amparo Lopez－ Rubio，Bernadine M Flanagan，Ashok K.Shrestha，et al.Molecular rearrangement of starch during in vitro digestion:Toward a better understanding of enzyme resistant starch formation in processed starches［J］.Biomacromolecules，2008，9:1951－1958.

［5］Michael J Gidley，Paul V Bulpin.Aggregation of Amylose in Aqueous Systems:The Effect of Chain Length on Phase Behavior and Aggregation Kinetics［J］.Macromolecules，1989，22:341－346.

［6］高群玉，蔡麗明.直鏈結(jié)晶淀粉形成過程中結(jié)晶度的變化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(18):18－21.

［7］黃贛輝，顧振宇，余飛，等.響應面優(yōu)化藕淀粉增抗的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(4):248－250.

［8］C Mutungi，C Onyango，T Doert，et al.Long－and short－range structural changes of recrystallized cassava starch subjected to in vitro digestion［J］.Food Hydrocolloids，2011，25:477－485.

［9］K Mahasukhonthachat，P A Sopade，M J Gidley.Kinetics of starch digestion in sorghum as affected by particle size［J］.Journal of Food Engineering，2010，96:18－28.