吳雪 袁金鐸 趙楠楠 楊桂文 安利國(guó)

（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省動(dòng)物抗性生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250014）

基因沉默（Gene silencing）作為生物學(xué)研究的新領(lǐng)域，吸引了無(wú)數(shù)生物學(xué)家的眼球，在近20年間有許多關(guān)于這一方面的研究及假說(shuō)被提出?；虺聊F(xiàn)象最早是Napoli 等發(fā)現(xiàn)，他們?cè)谶M(jìn)行轉(zhuǎn)基因紫牽?；ǖ难芯恐幸馔獍l(fā)現(xiàn)白色花和雜色花表型，后來(lái)證實(shí)該表型是由轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)植物體內(nèi)基因功能缺失所致，當(dāng)時(shí)稱這種現(xiàn)象為共抑制。1995年，Guo等［1]在對(duì)秀麗新小桿線蟲(chóng)進(jìn)行反義RNA技術(shù)的研究時(shí)，也出現(xiàn)了同樣的抑制現(xiàn)象。直至1998年，F(xiàn)ire等［2]將dsRNA導(dǎo)入線蟲(chóng)體內(nèi)，檢測(cè)該dsRNA對(duì)線蟲(chóng)的影響，結(jié)果證實(shí)外源dsRNA會(huì)使特定基因沉默，并且該沉默作用具有遺傳特性。他們將這種現(xiàn)象定義為RNA干擾作用（RNA interference，RNAi），也稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用（Post transcriptional genesilencing，PTGS）。

在發(fā)現(xiàn) RNAi作用后的幾年間，該技術(shù)作為熱點(diǎn)課題在多種生物中開(kāi)展研究。在真菌、果蠅 、擬南芥等生物體內(nèi)相繼發(fā)現(xiàn)了RNA i現(xiàn)象的存在［3]。1999年，再生模型渦蟲(chóng)體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了相同的基因沉默作用［4]，自此，RNAi作為一項(xiàng)能有效誘導(dǎo)特定基因功能缺失的新興技術(shù)，在渦蟲(chóng)發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究中發(fā)揮重要作用。近年，科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性小RNA同樣可以引起渦蟲(chóng)的基因沉默現(xiàn)象——miRNA、piRNA［5]，這種內(nèi)源性基因沉默作用涉及渦蟲(chóng)生命活動(dòng)的整個(gè)過(guò)程，如胚胎發(fā)育、干細(xì)胞維持、組織再生和配子形成等等，是渦蟲(chóng)維持正常生命活動(dòng)所必須的調(diào)控過(guò)程。但目前對(duì)于miRNA、piRNA的作用機(jī)制還不是很清楚，尚需進(jìn)一步試驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。

1 渦蟲(chóng)RNA干擾作用

1.1 RNA干擾機(jī)制

近年來(lái)對(duì)于RNAi技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，在此過(guò)程中主要有幾個(gè)控件發(fā)揮著重要作用，使得RNA干擾賴以發(fā)生。（1）雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）——觸發(fā)分子；（2）干擾性小RNA（small interfering RNA，siRNA）——重要效應(yīng)分子；（3）RNaseⅢ家族核酸酶（Dicer，DCR）——dsRNA剪切酶；（4）RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）—— 沉默誘導(dǎo)物；（5）RNA依賴的RNA聚合酶（RNA directed RNA polymerase，RdRP）——級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)酶。RNAi 發(fā)生機(jī)制大致分為3個(gè)階段，即啟動(dòng)階段：dsRNA進(jìn)入生物體內(nèi)，會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶識(shí)別并在ATP供能的條件下剪切成長(zhǎng)約 21-24個(gè)核苷酸（Nucleotide，nt）的片段，即siRNA。效應(yīng)階段：siRNA與 Dicer酶、Argonaute蛋白家族等分子結(jié)合形成RISC，但此時(shí)的RISC處于無(wú)活性狀態(tài)，無(wú)活性的RISC需在核酸內(nèi)切酶 Ago-2的作用下使siRNA解旋，解旋后的反義鏈RNA將作為“向?qū)А敝笇?dǎo)RISC識(shí)別靶mRNA。最終，RISC在Ago-2協(xié)助下降解靶mRNA，引發(fā)基因沉默［3，6]（圖1）。 級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)：由Dicer酶切割而成的siRNA除了與作用因子結(jié)合形成RISC之外，還能在RdRp的作用下，以靶mRNA為模板合成dsRNA，這些新合成的dsRNA最終也可被剪切成大量的siRNA，從而放大由siRNA引發(fā)的基因沉默作用，因此即使是很微量的dsRNA也能產(chǎn)生比較徹底的基因沉默效應(yīng)［7，8]。

1.2 RNA干擾技術(shù)在渦蟲(chóng)中的發(fā)現(xiàn)

渦蟲(chóng)以其驚人的再生能力聞名于世，早在1989年，Morgan等［9]就已發(fā)現(xiàn)即使將渦蟲(chóng)切成279段，其每一截段也可以再生成一個(gè)完整的個(gè)體，證實(shí)了渦蟲(chóng)強(qiáng)大地再生能力。除此之外，渦蟲(chóng)作為具有三胚層、左右對(duì)稱、頭部集中化等特性的最簡(jiǎn)單生物體，在后生動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程中占據(jù)重要地位［10]。在過(guò)去的一個(gè)世紀(jì)里，渦蟲(chóng)作為經(jīng)典的模型生物，為后生動(dòng)物乃至人類生物學(xué)難題的解答提供了重要的參考依據(jù)，尤其是渦蟲(chóng)再生機(jī)制的研究，對(duì)于脊椎動(dòng)物再生模型的建立具有重要意義［11]。但是由于缺乏行之有效的技術(shù)，渦蟲(chóng)的很多相關(guān)研究只局限在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平上，無(wú)法深入展開(kāi)，因此科學(xué)家們花費(fèi)大量的精力探索新的技術(shù)用于渦蟲(chóng)的深入研究。

1998年，科學(xué)家們?cè)诒葴u蟲(chóng)高等的線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了RNAi作用，主要通過(guò)dsRNA注射法進(jìn)行干擾。為了檢測(cè)這種方法是否會(huì)在渦蟲(chóng)體內(nèi)引發(fā)同樣的基因沉默現(xiàn)象，Alvarado等［4]選取了體壁肌肉組織、具纖毛的腹部上皮組織、光感受器3個(gè)渦蟲(chóng)易于檢測(cè)的代表性部位進(jìn)行RNAi測(cè)定試驗(yàn)。研究結(jié)果表明：dsRNA注射法在渦蟲(chóng)體內(nèi)會(huì)引起同樣的基因沉默效果；dsRNA注射法在渦蟲(chóng)體內(nèi)所引發(fā)的基因沉默效應(yīng)是特異的；dsRNA在渦蟲(chóng)體內(nèi)通過(guò)降解靶mRNA致使基因功能喪失。Alvarado的試驗(yàn)結(jié)果作為一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)，證實(shí)了RNAi技術(shù)在渦蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)揮的強(qiáng)大功效，為RNAi技術(shù)在渦蟲(chóng)生物學(xué)研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

隨著RNAi作用在渦蟲(chóng)中的發(fā)現(xiàn)，很多科學(xué)家對(duì)該領(lǐng)域產(chǎn)生了濃厚的興趣。他們嘗試用一些改良的方法來(lái)誘導(dǎo)渦蟲(chóng)體內(nèi)的基因沉默作用，如dsRNA飼喂法和siRNA浸泡法，都較為成功的起到了基因干擾作用［10]。在之后的10多年時(shí)間里，dsRNA注射法與dsRNA飼喂法作為渦蟲(chóng)RNAi技術(shù)的主要方法，在渦蟲(chóng)基因功能和再生機(jī)制的研究中發(fā)揮著無(wú)法替代的作用。

1.3 RNA干擾技術(shù)在渦蟲(chóng)中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)的應(yīng)用，克服了渦蟲(chóng)研究技術(shù)的局限性，為渦蟲(chóng)基因功能的研究準(zhǔn)備了條件。2005年，Reddien等［12]在EST庫(kù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合RNAi技術(shù)，建立了第一個(gè)以siRNA干擾基因功能為基礎(chǔ)的渦蟲(chóng)RNAi基因篩選文庫(kù)。這一文庫(kù)的建立為渦蟲(chóng)更好地作為模型生物在發(fā)育生物學(xué)研究中發(fā)揮作用奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也掀起了渦蟲(chóng)基因水平研究的新高潮，此后，科學(xué)家們積極開(kāi)展渦蟲(chóng)RNAi的相關(guān)研究。

1.3.1 渦蟲(chóng)RNAi多樣化表型的確定 Reddien等［5]建立的RNAi基因篩選文庫(kù)中，對(duì)瑞士種渦蟲(chóng)進(jìn)行代表性取樣，選取53 400個(gè)渦蟲(chóng)截段，干擾1 065個(gè)基因，共篩選出240個(gè)代表性表型類別，用于渦蟲(chóng)再生和穩(wěn)態(tài)的研究。對(duì)這240個(gè)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中的大部分基因在進(jìn)化上存在高度的保守性——205個(gè)（85%）基因在其他生物體的基因組中發(fā)現(xiàn)了序列相似的同源基因。例如，渦蟲(chóng)中有38個(gè)基因的編碼序列與人類某些疾病的引發(fā)序列存在同源性，在渦蟲(chóng)中對(duì)這些基因進(jìn)行深入研究，有望開(kāi)發(fā)出治療人類相關(guān)疾病的藥物，并且渦蟲(chóng)特定基因干擾表型易于獲得，這也為相關(guān)疾病基因的研究提供了便利的條件。另外，還有35個(gè)無(wú)任何進(jìn)化保守性的渦蟲(chóng)基因，這些基因被認(rèn)為是扁形動(dòng)物維持自身生命活動(dòng)所必需的看家基因，在很多扁形綱的病原蟲(chóng)中這些基因也起至關(guān)重要的作用。因此可以針對(duì)這些已知的病原基因，設(shè)計(jì)相應(yīng)有效的生物制劑，用于疾病的防御和治療。渦蟲(chóng)RNAi多樣化表型的確定，是渦蟲(chóng)基因功能研究的先決條件，為特定疾病的控制和治愈提供了有效信息，為疾病的檢測(cè)技術(shù)提供了強(qiáng)大后盾［13]。

1.3.2 RNAi在渦蟲(chóng)neoblast研究中的應(yīng)用 Neoblast即渦蟲(chóng)成體干細(xì)胞，主要存在于渦蟲(chóng)的間充質(zhì)區(qū)，是渦蟲(chóng)體內(nèi)唯一具有增殖分裂活性的細(xì)胞，渦蟲(chóng)的neoblast占其細(xì)胞總數(shù)的20%以上，因而可作為模式生物用于干細(xì)胞的研究［14]。在RNAi機(jī)制被發(fā)現(xiàn)之前，主要是通過(guò)紫外照射法特異性殺傷neoblast，但紫外線的殺傷作用具有非特異性，因此無(wú)法對(duì)neoblast的特定基因進(jìn)行專門研究。而Reddien［5]通過(guò)RNAi作用篩選出導(dǎo)致neoblast表型異常的基因——異常表型與紫外照射的渦蟲(chóng)截段表型相似。再對(duì)這些篩選出的基因進(jìn)行分組干擾試驗(yàn)，從而確定出neoblast發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵基因：smedwi-2和smedwi-3［15]。近年，Salvetti等［16]用相同的RNA干擾方法在渦蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)到果蠅Pumilio的同源基因DjPum，該基因?qū)τ趎eoblast數(shù)量和形態(tài)的維持起重要作用。Guo等［17]將渦蟲(chóng)干細(xì)胞中的Bruno-like基因干擾后，neoblast將不能進(jìn)行自我更新。除此之外，在瑞士種渦蟲(chóng)中還發(fā)現(xiàn)vasa、piwi、tudor和nanos的同源基因，這些基因功能的缺失會(huì)引起neoblast數(shù)量的明顯減少，表明它們是維持neoblast活性所必需的［18]。neoblast相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)為成功分離和培養(yǎng)渦蟲(chóng)干細(xì)胞準(zhǔn)備了條件，為人類更好地了解干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制提供了有價(jià)值的線索［19]。

1.3.3 RNAi在渦蟲(chóng)再生研究中的應(yīng)用 渦蟲(chóng)的再生過(guò)程主要伴隨著胚基發(fā)生和neoblast分化而進(jìn)行，所有與neoblast的發(fā)生分化相關(guān)的基因在渦蟲(chóng)的再生過(guò)程中都起著重要作用，除此之外，再生過(guò)程中還涉及很多其他基因的相互作用，是一個(gè)非常復(fù)雜的基因調(diào)控過(guò)程。將RNAi文庫(kù)中已鑒定出的240個(gè)干擾表型，按截段的再生階段和胚基大小進(jìn)行分類，針對(duì)各分類表型中的相應(yīng)基因進(jìn)行功能測(cè)定，從而確定出再生過(guò)程中各階段的關(guān)鍵作用因子。Cebrià等［20]通過(guò)干擾roboA基因，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)在調(diào)控渦蟲(chóng)前端形態(tài)發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因干擾后，出現(xiàn)前端再生異常表型。Lapan［21]發(fā)現(xiàn)渦蟲(chóng)眼點(diǎn)再生過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子——ovo，OVO缺少時(shí)渦蟲(chóng)無(wú)法形成正常的眼點(diǎn)結(jié)構(gòu)。FGF-like受體nou-darake基因被認(rèn)為可能與渦蟲(chóng)頭部再生有關(guān)，該基因敲除后，可誘導(dǎo)渦蟲(chóng)的其他部位形成異位的大腦和眼點(diǎn)［22]。此外，Kobayashi和Iglesias等［23，24]通過(guò)對(duì)DjwntA基因的干擾作用證實(shí)：Wnt在渦蟲(chóng)再生過(guò)程前后軸極性的確立中起關(guān)鍵作用，并且發(fā)現(xiàn)了DjwntA和nou-darake/FGFR信號(hào)通路間的相互作用。通過(guò)分析這些已確定的再生因子，科學(xué)家們正逐步建立起渦蟲(chóng)的再生模型。該模型的建立有助于闡明高等動(dòng)物細(xì)胞分化及器官再生的分子機(jī)制，將給人類疾病的治療、組織器官損傷的修復(fù)帶來(lái)新的希望。

2 渦蟲(chóng)內(nèi)源性基因沉默

2.1 miRNA介導(dǎo)的內(nèi)源性基因沉默

近年，在渦蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)另一條引發(fā)基因沉默的途徑。該途徑的主要效應(yīng)因子為miRNA（microRNAs）：miRNA與siRNA同為20-25 nt單鏈小分子RNA，但與外源性干擾siRNA所不同，miRNA是由內(nèi)源性具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 pre-miRNA 加工而成，因此該過(guò)程又稱為內(nèi)源性基因沉默作用?；蚪M中位于內(nèi)含子或基因間隔區(qū)的非編碼基因經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成pri-miRNA，pri-miRNA在Drosha及其輔助因子DGCR8/PASHAR的作用下去除帽、尾結(jié)構(gòu)成為pre-miRNA［25，26]，再經(jīng)Dicer 酶切割成 20-25 nt的miRNA：miRNA*配對(duì)分子，最終成熟的miRNA 從miRNA：miRNA*雙體中分離出來(lái)，與Argonaute蛋白結(jié)合形成沉默誘導(dǎo)復(fù)合體并進(jìn)行靶基因識(shí)別，從而誘發(fā)內(nèi)源性基因沉默作用［27，28]。近來(lái)的研究結(jié)果表明，miRNA 在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，miRNA介導(dǎo)的內(nèi)源性基因沉默作用涉及渦蟲(chóng)生命活動(dòng)的整個(gè)過(guò)程，如胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、干細(xì)胞維持及組織再生等是渦蟲(chóng)維持正常生命活動(dòng)所必須的調(diào)控過(guò)程［29]。

渦蟲(chóng)體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了多種基因，它們與其他物種中編碼miRNA發(fā)生相關(guān)蛋白的基因同源，當(dāng)被敲除時(shí)會(huì)導(dǎo)致渦蟲(chóng)再生過(guò)程的異常，表明miRNA在渦蟲(chóng)再生和neoblast維持過(guò)程中是必須的。例如，Ago-2作為渦蟲(chóng)形成沉默誘導(dǎo)復(fù)合體的必需蛋白，被RNAi技術(shù)沉默后，不僅阻礙了再生過(guò)程，而且neoblast的數(shù)量也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)［30，31]。目前，在瑞士種渦蟲(chóng)中已鑒定出很多保守的miRNA和miRNA簇，預(yù)測(cè)這些miRNA在渦蟲(chóng)中具有相似功能。對(duì)渦蟲(chóng)miRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了兩類miRNA：strain-specific miRNA和neoblast-specific miRNA［32]。

2.1.1 strain-specific miRNA 瑞士種渦蟲(chóng)具有有性品系和無(wú)性品系兩種，有性品系成熟個(gè)體同時(shí)具有雌性生殖系統(tǒng)和雄性生殖系統(tǒng)，即雌雄同體。而無(wú)性品系缺少成熟的生殖器官，只能進(jìn)行裂體生殖。Newmark［9]對(duì)兩品系進(jìn)行核型分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)性品系中的染色體易位現(xiàn)象可能是導(dǎo)致其無(wú)法產(chǎn)生成熟生殖器官的根本原因。通過(guò)高通量測(cè)序?qū)善废档膍iRNA進(jìn)行分析，尋找出很多品系特異miRNA，其中大部分的無(wú)性品系miRNA為渦蟲(chóng)所特有的［33]。雖然這些特異miRNA與染色體易位現(xiàn)象間的關(guān)系還不是很清楚，但可以確定它們確實(shí)在渦蟲(chóng)品系分化中發(fā)揮作用，這些miRNA的發(fā)現(xiàn)為渦蟲(chóng)生殖模型的建立準(zhǔn)備了條件。

2.1.2 neoblast-specific miRNA 通過(guò)對(duì)紫外處理組和非處理組渦蟲(chóng)miRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，鑒定出許多在neoblast中特異表達(dá)的miRNA。例如，miRNA簇mir71a/2d/13/752中的41個(gè)miRNA進(jìn)行整體原位雜交，雜交痕跡主要定位在神經(jīng)系統(tǒng)和上皮組織的neoblast中［33，34]。渦蟲(chóng)中有斑馬魚(yú)mir-133的同源基因，Wnt 和Fgf是該基因的主要作用靶點(diǎn)——它們是渦蟲(chóng)傷口愈合、干細(xì)胞再生及前后軸極化所必需的［35]。最近的研究顯示，渦蟲(chóng)miRNA可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，因?yàn)楹芏鄿u蟲(chóng)miRNA的作用靶點(diǎn)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生過(guò)程中的關(guān)鍵因子，但這些特異miRNA對(duì)神經(jīng)鏈接進(jìn)行再生修復(fù)的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。

2.2 piRNA介導(dǎo)的內(nèi)源性基因沉默

2006年，《Nature》和《Science》雜志同時(shí)刊載了關(guān)于piRNA分子的報(bào)道。piRNA是一種26-31nt組成的內(nèi)源性單鏈小RNA，主要分布在轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列等區(qū)域?？赏ㄟ^(guò)Piwi-piRNA復(fù)合物引起基因沉默從而調(diào)控生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，是多種生物生殖發(fā)育得以順利進(jìn)行的重要保障［36-38]。piRNA最早在雄性小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)，這些小RNA特異地與Piwi 蛋白家族的成員相互作用，因而被命名為 Piwiinteracting RNAs，即 piRNAs［39]。隨后，Reddien在渦蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)了piRNA。它們可與渦蟲(chóng)的Piwi同源蛋白Smedwi-2、Smedwi-3相互作用。Smedwi蛋白家族在維持渦蟲(chóng)干細(xì)胞性能中起作用，piRNA可通過(guò)沉默Smedwi-2、Smedwi-3的表達(dá)來(lái)完成對(duì)干細(xì)胞形態(tài)數(shù)量的調(diào)控［15]。渦蟲(chóng)piRNA在染色體上的分布位置具有保守性。同時(shí)，其形成過(guò)程也遵循其他物種所適用的“乒乓模型”（ping pang model）假說(shuō)。2008年，Palakdoeti［15]證實(shí)，渦蟲(chóng)piRNA確實(shí)具有與其他物種piRNA相似的功能，即piRNA在渦蟲(chóng)生殖干細(xì)胞命運(yùn)決定、減數(shù)分裂、精子發(fā)生等配子形成事件中發(fā)揮重要作用［34]。目前，對(duì)于渦蟲(chóng)piRNA的研究較少，對(duì)其分子特征及作用機(jī)制還不是很清楚。有人認(rèn)為，piRNA能通過(guò)表觀遺傳調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式發(fā)揮基因沉默作用［40，41]，但尚需進(jìn)一步探究考證。

3 結(jié)語(yǔ)

RNA干擾技術(shù)在渦蟲(chóng)的基因功能研究中有著廣泛的應(yīng)用，對(duì)其機(jī)制和功能的研究比較透徹。miRNA 和piRNA 介導(dǎo)的內(nèi)源性基因沉默作用作為一種重要的調(diào)節(jié)機(jī)制，在渦蟲(chóng)新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、繁衍后代的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但目前對(duì)于這些小RNA的研究較少，對(duì)它們的作用機(jī)制和功能特性還不是很清楚。在未來(lái)的試驗(yàn)中，可以應(yīng)用新的測(cè)序技術(shù)對(duì)不同再生階段中的各類細(xì)胞和組織進(jìn)行小RNA表達(dá)檢測(cè)。同時(shí)，利用定點(diǎn)監(jiān)測(cè)技術(shù)明確miRNA和piRNA的作用靶點(diǎn)，從而建立起渦蟲(chóng)小RNA 在干細(xì)胞維持及再生調(diào)節(jié)中的作用模型。另外，在生物體中還檢測(cè)到許多其他非編碼小RNA的存在。如snoRNAs和lncRNAs［42]，它們可調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程，猜測(cè)在渦蟲(chóng)中也具有相似的功能，可通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

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