李波，孫天穎，于鑫洋

（1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

紫花苜蓿是一種優(yōu)質(zhì)且高產(chǎn)的多年生豆科牧草，是我國推廣應(yīng)用的主要牧草，其品質(zhì)好、產(chǎn)量高、適口性好、易于家畜消化，故有“牧草之王”的美譽(yù)。除了有很高的營養(yǎng)價(jià)值，它還有許多藥用價(jià)值，可鎮(zhèn)痛、保肝、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤、抗風(fēng)濕、抗細(xì)菌、抗動(dòng)脈硬化，還用于治療糖尿病、高血脂、雌激素失調(diào)等癥[1]。目前，苜蓿皂苷提取工藝的研究還處于實(shí)驗(yàn)室階段，對其生理活性的研究才剛剛起步。本實(shí)驗(yàn)對苜?？傇碥者M(jìn)行提取，并對其抑菌效果和抗氧化的能力進(jìn)行深入研究，為苜蓿的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與藥品

肇東苜蓿葉：取自黑龍江省畜牧研究所；菌種為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、面包酵母、根霉、黃曲霉、綠霉：由莫繼先老師（齊齊哈爾大學(xué)）提供；石油醚、正丁醇、香草醛、高氯酸、水楊酸、過氧化氫、DPPH、鄰苯三酚、Tris、菲咯嗪等，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 苜蓿皂苷的提取

苜蓿粉→浸泡→最佳超聲條件提取（時(shí)間30 min，溫度20°C，功率80 W）→減壓蒸餾→萃取3 次（石油醚）→萃取3 次（正丁醇）→減壓蒸餾→香草醛高氯酸比色法測定吸光值→由齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007 4x-0.244 5[2]得皂苷含量。

1.2.2 苜蓿皂苷對不同菌的抑制作用

將菌種活化后制含菌平板，用濾紙片法測定皂苷對不同菌的抑菌效果，對有抑菌效果的菌種測定其最低抑菌濃度。

1.2.3 清除羥基自由基活性

用水楊酸捕獲法[3]測定產(chǎn)生的2，3-二羥基苯甲酸在510 nm 處的吸收值變化來確定清除率。

1.2.4 清除超氧自由基活性

用鄰苯三酚自氧化法[4]測定產(chǎn)生的有色中間產(chǎn)物在325nm 處的吸收值變化，確定對該自由基的清除率。

1.2.5 清除DPPH 自由基活性

用捕獲DPPH 自由基法[5]測定DPPH 醇溶液在517 nm 處的吸收值變化，確定皂苷的清除率。

1.2.6 螯合Fe2+能力

以菲咯嗪為顯色劑[6]，測定其在562 nm 處的吸收值變化，確定皂苷對Fe2+的螯合能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿皂苷的抑菌作用

苜蓿皂苷的抑菌效果見表1。

表1 苜蓿皂苷的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of alfalfa saponins

表1 顯示三種濃度的皂苷提取液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌兩種細(xì)菌有抑制作用，對其他五種真菌沒有抑制作用。苜蓿皂苷對兩種細(xì)菌的抑菌圈的大小，見表2。

表2 苜蓿皂苷對兩種細(xì)菌的抑菌效果Table 2 The inhibition effects of alfalfa saponin on two kinds of bacteria

在測定抑菌圈大小時(shí)發(fā)現(xiàn)3 種不同濃度的皂苷提取液對細(xì)菌的抑制作用不同。利用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)分析：3 種濃度的皂苷溶液對枯草芽孢桿菌抑菌效果之間差異極顯著（F=281.692，P<0.01）；對大腸桿菌抑制效果差異極顯著（F=940.809，P<0.01）。兩種細(xì)菌在同一皂苷濃度下，抑菌效果差異極顯著。

兩種細(xì)菌的最低抑菌濃度結(jié)果見表3。

表3 細(xì)菌的最低抑菌濃度Table 3 The minimum inhibitory concentration of bacteria

由表3 可知6 種不同濃度的皂苷提取液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為0.024 0 mg/mL和0.047 9 mg/mL。兩者相比枯草芽孢桿菌對抑制濃度的要求更高。

2.2 苜蓿皂苷的抗氧化活性測定

苜蓿皂苷的抗氧化活性和抗氧化能力分別見表4和圖1。

表4 苜蓿皂苷的抗氧化活性Table 4 The antioxidant activity of alfalfa saponins

圖1 苜蓿皂苷的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant of alfalfa saponins

圖1 和表4 的分析顯示，苜蓿皂苷對羥基、超氧、DPPH3 種自由基均有清除作用，對Fe2+有螯合作用。且抗氧化能力和皂苷濃度呈線性關(guān)系，即清除能力和螯合能力隨著皂苷濃度的升高而增強(qiáng)。同一濃度的皂苷提取液對DPPH 自由基的清除作用最強(qiáng)。

3 結(jié)論

皂苷提取液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌兩種細(xì)菌有抑制作用，對酵母、黑曲霉、黃曲霉、根霉、綠霉五種真菌沒有抑制作用。3 種不同濃度的皂苷提取液對細(xì)菌比對真菌的抑制作用更強(qiáng)。皂苷對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度分別為0.024 0 mg/mL 和0.047 9 mg/mL。

皂苷提取液對羥基、超氧、DPPH 三種自由基均有清除作用，對Fe2+有螯合作用?？寡趸芰εc皂苷濃度之間呈現(xiàn)線性關(guān)系，即清除能力和螯合能力隨著皂苷濃度的升高不斷增強(qiáng)。且同一濃度的皂苷提取液對DPPH 自由基的清除作用最強(qiáng)。

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