張 毅，佟笑竹，徐小嫚，張 萌，曲 丹，何 平*

前列腺癌是嚴(yán)重威脅老年男性健康的疾病，是老年男性最常見的惡性腫瘤之一［1-2］。目前藥物治療方法主要有化療、內(nèi)分泌治療以及中藥治療等［3］。但臨床治療效果不能令人滿意，因此，尋找對前列腺癌更有效的治療藥物尤為重要。蛇床子素是蛇床子果實中提取的一種天然化合物?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有抗心律失常、增強免疫功能、抗菌及抗病毒等多種藥理作用［4-5］，且在抗腫瘤方面的作用明顯，可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲等［6-10］。但蛇床子素對前列腺癌的抑制作用未見報道。本實驗就蛇床子素對人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖的影響及機制進行研究，以期為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌DU145 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫;蛇床子素(純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所，溶解于二甲基亞砜(DMSO)，配制成100 mmol/L 的儲存液，-20 ℃保存?zhèn)溆?RPMI-1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司;胎牛血清購自天津索萊寶生物工程有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、DMSO 及Hoechst 33342 購自美國Sigma公司;AnnexinV/PI 雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;甲醇、冰乙酸由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌DU145 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 將DU145 細(xì)胞制成1 ×105/mL 的細(xì)胞懸液，每孔100 μL 接種于96 孔板內(nèi)，實驗每個劑量設(shè)3 個平行孔。于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加系列稀釋含蛇床子素的培養(yǎng)基，使其終濃度依次為30、60、90、120 μmol/L。實驗同時設(shè)含RPMI-1640 全培養(yǎng)基的空照和未予藥物作用的陰性對照，24、48 h各測1 次指標(biāo)。方法為在各檢測時間前4 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至實驗結(jié)束。棄上清，每孔加DMSO 150 μL，振蕩混勻，酶標(biāo)儀檢測波長570 nm 的每孔光密度值(OD 值)。計算細(xì)胞的增殖抑制率，抑制率=1-加藥組OD 值/對照組OD 值×100%，實驗重復(fù)3 次。

1.4 流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI 雙染法檢測蛇床子素誘導(dǎo)DU145 細(xì)胞凋亡 將DU145 細(xì)胞制成5 ×105/mL 的細(xì)胞懸液，每孔2 mL 接種于6 孔板中，于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入蛇床子素，使各組蛇床子素的終濃度為0、30、90 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化、離心收集細(xì)胞。用500 μL 1 ×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106/mL。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL AnnexinV-FITC 輕輕混勻，再加入5 μL PI 后輕輕混勻，避光孵育15 min，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3 次。

1.5 熒光電子顯微鏡觀察DU145 細(xì)胞凋亡形態(tài) 將DU145 細(xì)胞制成5 ×105/mL 的細(xì)胞懸液，每孔2 mL 接種于6 孔板中，于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入蛇床子素，使蛇床子素的終濃度為0、90 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，冷PBS 洗2 次，冷風(fēng)吹干，固定液(甲醇與冰乙酸的體積比為3∶1)固定15 min，PBS再洗 1 次。加入 Hoechst 33342 熒光染料(5 mg/L)1 mL，37 ℃避光孵育15 min，于熒光顯微鏡下觀察、照相。實驗重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間比較采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對DU145 細(xì)胞體外增殖的抑制作用 MTT 法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的蛇床子素作用于DU145 細(xì)胞24 、48 h 后，細(xì)胞增殖水平明顯受到抑制。隨著濃度的增大和作用時間的延長，蛇床子素對DU145 細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，這種抑制效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的時間劑量依賴性(P＜0.05)(見圖1)。

圖1 蛇床子素對人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 流式細(xì)胞檢測蛇床子素誘導(dǎo)DU145 細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI 雙染法檢測結(jié)果顯示，不同濃度蛇床子素作用于DU145 細(xì)胞24 h 后，隨著蛇床子素濃度的增加，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加，并呈劑量依賴性(見圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測蛇床子素誘導(dǎo)DU145 細(xì)胞凋亡

2.3 熒光電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) Hoechst 33342 染色熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，90 μmol/L蛇床子素作用于DU145 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞核形態(tài)變化顯著，呈現(xiàn)核固縮、核碎裂等典型凋亡改變。而空白對照組無相應(yīng)改變，細(xì)胞核形態(tài)正常(見圖3)。

3 討論

本研究選取的藥物蛇床子素又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，是從傘形科植物成熟果實蛇床子中提取分離出的天然香豆素類化合物，其化學(xué)名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素。近年來，有關(guān)蛇床子素藥理作用的研究有了很大進展，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗心律失常、增強免疫功能、抗菌及抗病毒等多種藥理活性［4-7］。

圖3 熒光電子顯微鏡(Hoechst33342 染色400 ×)觀察細(xì)胞核形態(tài)變化

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有明顯抗腫瘤活性。Xu 等［6-7］研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可以通過將細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制肺腺癌A549 細(xì)胞增殖，其分子機制與調(diào)控PI3K/Akt 通路有關(guān);蛇床子素可以抑制A549 細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，其機制與抑制MMP-2、MMP-9 表達(dá)有關(guān)。Yang 等［8］報道，蛇床子素可以通過抑制MMP-2表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 和MDA-MB 231的侵襲。Hung 等［9］進一步研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素通過抑制c-Met/Akt/mTOR 通路，發(fā)揮其抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的作用。Zhang 等［10］報道，蛇床子素抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G2/M 期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機制與抑制NF-kB活性相關(guān)。此外，蛇床子素還可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡［11］，誘導(dǎo)白血病HL-60 細(xì)胞凋亡［12］，對肺癌細(xì)胞接種的荷瘤小鼠有抑制腫瘤生長作用［13］。但蛇床子素對前列腺癌是否有抑制作用未見報道。本實驗采用人前列腺癌DU145 細(xì)胞為研究對象，實驗結(jié)果表明，蛇床子素對DU145 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且有時間劑量依賴關(guān)系。蛇床子素可誘導(dǎo)DU145 細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡觀察到了細(xì)胞凋亡的形態(tài)，進一步證實了蛇床子素的抗前列腺癌作用。

綜上所述，蛇床子素可以抑制前列腺癌DU145 細(xì)胞的增殖，其機制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為蛇床子素在治療前列腺癌方面提供了實驗依據(jù)，其詳細(xì)分子機制有待進一步深入研究。

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