李夢(mèng)瑤，王 楓，侯喜林，蔣 倩，馬 靜，熊愛(ài)生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(profilin)是1 種相對(duì)分子質(zhì)量12 000 ～15 000 的蛋白質(zhì)，其功能是在植物體內(nèi)將肌動(dòng)蛋白單體隔開(kāi)、抑制肌動(dòng)蛋白絲的生長(zhǎng)，并在植物細(xì)胞中參與微絲的快速重組，例如胞質(zhì)分裂、胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞延長(zhǎng)以及花粉管和根毛生長(zhǎng)等［1-2］。由于其廣泛分布于各種有致敏作用的植物器官中，因而profilin 也被稱為泛變應(yīng)原(panallergen)［3］。泛變應(yīng)原是一類氨基酸序列高度保守的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是引起花粉和植物性食物間發(fā)生交叉反應(yīng)的主要因素之一［1］。自白樺(Betula platyphylla Suk.)中次變應(yīng)原Bet v 2 被證實(shí)為 profilin［4］起，目前已有學(xué)者從棕櫚〔Trachycarpus fortunei (Hook.) H. Wendl.〕、桃(Amygdalus persica Linn.)、油 橄 欖 (Olea europaea Linn.)和梯牧草(Phleum pratense Linn.)等許多植物中均分離出泛變應(yīng)原 profilin［5-9］。

旱芹(Apium graveolens Linn.)俗稱芹菜，是傘形科(Apiaceae)一年或多年生草本植物，起源于地中海和中東地區(qū)，目前在世界范圍內(nèi)均有栽培。芹菜中含有豐富的胡蘿卜素、維生素、揮發(fā)油及有機(jī)酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的食用和藥用價(jià)值，其中的芹菜素和黃酮等生物活性成分還具有降低血壓、調(diào)節(jié)血脂和降血糖的功效［10-11］。但芹菜是常見(jiàn)的過(guò)敏性食物之一，目前已從芹菜中分離出的過(guò)敏原蛋白有Api g 1、Api g 2、Api g 4 和 Api g 5［12-13］。因 Api g 4 與白樺中的Bet v 2 具有較高的同源性且能發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，引起相關(guān)科研人員的關(guān)注。

鑒于此，作者從形態(tài)相近、地域來(lái)源不同的2 個(gè)芹菜品種‘津南實(shí)芹’(‘Jinnanshiqin’)和‘美國(guó)西芹’(‘Meiguoxiqin’)中分別克隆出Api g 4 基因，利用生物信息學(xué)方法推導(dǎo)其氨基酸序列，并對(duì)其氨基酸組成、疏水性、空間結(jié)構(gòu)及其與其他植物的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析，以期為芹菜致敏性及過(guò)敏原之間關(guān)系的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試芹菜品種為本實(shí)驗(yàn)室保存的‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’，種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室和江浦實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。大腸桿菌菌株DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒載體 pMD18-T Vector、DNA 分子量 marker、Ex Taq DNA 聚合酶、Prime Script RT reagent Kit 和 SYBR Premix Ex Taq 試劑盒等均為寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn);RNA simple Total RNA Kit 由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。

實(shí)驗(yàn)儀器有超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、全溫震蕩培養(yǎng)箱(美國(guó)精騏有限公司)、PCR儀(德國(guó)Eppendorf 公司)、DYY-6C 瓊脂糖凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)和ABI7300 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法

1.2.1 不同組織中總RNA 提取及cDNA 合成 采用RNA simple Total RNA Kit 分別從‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’成熟植株的根、莖和葉等組織中提取總RNA。用Prime Script RT reagent Kit 將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 Api g 4 基因的克隆 根據(jù) GenBank 中 Api g 4基因序列(登錄號(hào)為AF129423)設(shè)計(jì)1 對(duì)引物NXR29和NXR30，序列分別為5'-TTGCATGCGGACGGTGCT GTA-3'和 5'-GGAATAACTAGTCCCGGACATT-3'。以2 個(gè)品種的cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性30 s，54 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共30 個(gè)循環(huán);最后于72 ℃ 延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶，連接到pMD18-T 載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α 中，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng) 用芹菜 actin 基因作為參考基因，與目標(biāo)基因一起擴(kuò)增，表達(dá)檢測(cè)引物為ACTIN-F 和 ACTIN-R，序列分別為5'-GTTAGTAT ATACCGTCCTTC-3'和5' -GTACTTTAGCTCCACGA CCG-3'。根據(jù)2 個(gè)品種的Api g 4 基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物NXR81 和NXR82，序列分別為5'-CGAAT TAGACTCCTTTTCTCC-3'和5' -CTACTTGGACAAT GAGGTCC-3'。采用 SYBR Premix Ex Taq 試劑盒并按照操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以芹菜actin 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平為內(nèi)參，計(jì)算目的基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平 2-ΔΔCt。其中，ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct內(nèi)參)處理組-(Ct靶基因-Ct內(nèi)參)對(duì)照組(式中，Ct 表示每個(gè) PCR 反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))［14］。

1.3 序列分析

采用Clustal X 軟件進(jìn)行氨基酸組成與多序列比對(duì);利用 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)的 BLASTp 程序計(jì)算同源性;使用 MEGA4. 0 軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析［15］;通過(guò)SWISS-MODEL(http:∥swiss-model. expasy. org)建立蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型［16］。

2 結(jié)果和分析

2.1 芹菜Api g 4 基因的克隆與序列分析

分別以‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’2 個(gè)品種的cDNA 為模板、采用 NXR29 和 NXR30 引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，分別得到長(zhǎng)度約為400 bp 的片段(見(jiàn)圖1)，其片段長(zhǎng)度與預(yù)期片段一致。序列分析結(jié)果表明:‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’的Api g 4 基因均含有1 個(gè)長(zhǎng)度405 bp 的開(kāi)放閱讀框(ORF，open reading frame)，分別編碼134 個(gè)氨基酸。其中‘津南實(shí)芹’Api g 4 基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列見(jiàn)圖2。2個(gè)品種Api g 4 基因的核苷酸序列有3 個(gè)堿基的差異，分別為第85 位的 G/A、第149 位的 C/T 和第318 位的C/T;2 個(gè)品種的Api g 4 基因編碼的氨基酸序列有2個(gè)位點(diǎn)的差異，分別為第29 位的Val/Thr 和第50 位的Thr/Ile。

圖1 2 個(gè)芹菜品種Api g 4 基因cDNA 的PCR 擴(kuò)增圖譜Fig. 1 PCR amplification pattern of cDNA of Api g 4 gene from two cultivars of Apium graveolens Linn.

圖2 芹菜品種‘津南實(shí)芹’Api g 4 基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequence of Api g 4 gene from Apium graveolens‘Jinnanshiqin’and its encoding amino acid sequence

2.2 芹菜Api g 4 基因及其他植物泛變應(yīng)原基因編碼的氨基酸序列比較及同源性分析

BLASTp 同源性檢索與比對(duì)［17］結(jié)果表明:‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’Api g 4 基因編碼的氨基酸序列與歐芹〔Petroselinum crispum (Miller)Nyman ex A.W. Hill〕、胡蘿卜(Daucus carota Linn.)、油橄欖(Olea europaea Linn.)、大豆〔Glycine max (Linn.)Merr.〕、歐洲榛(Corylus avellana Linn.)、蓖麻(Ricinus communis Linn.)、栓皮櫟(Quercus suber Linn.)、毛果楊(Populus trichocarpa Torr. et A. Gray)、山腚(Mercurialis annua Linn.)、樟樹(shù)〔Cinnamomum camphora (Linn.)Presl〕、葡萄 (Vitis vinifera Linn.)、垂枝樺 (Betula pendula Roth.)、葎草〔Humulus scandens (Lour.)Merr.〕、玉山筷子芥 (Abaris lyrata Linn.)、煙 草 (Nicotiana tabacum Linn.)、擬南芥〔Arabidopsis thaliana (Linn.)Hey.〕、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)和蘋果(Malus pumila Miller)的泛變應(yīng)原氨基酸序列相似度較高，其中與同科植物歐芹和胡蘿卜的同源一致性分別達(dá)到94%和91%，與其他種類的同源一致性約為80%。將‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’Api g 4 基因編碼的氨基酸序列與上述種類泛變應(yīng)原基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果表明(圖3):這些泛變應(yīng)原的氨基酸序列保守區(qū)域較大，且連續(xù)相同的氨基酸殘基數(shù)目較多，最長(zhǎng)片段的氨基酸殘基數(shù)達(dá)到8 個(gè)，分別為KYMVIQGE 和AVIRGKKG，推測(cè)它們可能是潛在的抗原決定簇，能夠引發(fā)機(jī)體的過(guò)敏反應(yīng)。

圖3 2 個(gè)芹菜品種Api g 4 基因編碼的氨基酸序列與其他植物泛變應(yīng)原氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig. 3 Alignment result of amino acid sequences encoded by Api g 4 gene from two cultivars of Apium graveolens Linn. with that of panallergens from other species

為了進(jìn)一步分析從‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’中分離的Api g 4 基因編碼的蛋白質(zhì)與其他植物泛變應(yīng)原的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了同源進(jìn)化樹(shù)(圖4)，結(jié)果表明:‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’的Api g 4 蛋白與同科的歐芹和胡蘿卜所含的泛變應(yīng)原蛋白進(jìn)化關(guān)系最近。

2.3 ‘津南實(shí)芹’Api g 4 基因編碼的氨基酸序列疏水性/親水性分析

對(duì)克隆獲得的‘津南實(shí)芹’Api g 4 基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行了DNAMAN 疏水性/親水性分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明:該蛋白的第105 位纈氨酸(Val)疏水性最強(qiáng)，第27 位丙氨酸(Ala)和第26 位丙氨酸(Ala)的疏水性其次;第89 位賴氨酸(Lys)親水性最強(qiáng)，第88 位甘氨酸(Gly)和第56 位天冬氨酸(Asp)的親水性其次?？傮w上看(圖5)，‘津南實(shí)芹’Api g 4 基因編碼的蛋白屬于疏水性蛋白。此外，對(duì)‘美國(guó)西芹’Api g 4 基因編碼的氨基酸序列的疏水性/親水性分析結(jié)果也顯示:‘美國(guó)西芹’的Api g 4 基因編碼的蛋白也屬于疏水性蛋白。

2.4 芹菜Api g 4 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

以橡膠樹(shù)〔Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.)Muell. Arg.〕的變應(yīng)原 Hevb8 的 Chain A(PDB ID:1G5U)為模型，通過(guò)SWISS-MODEL 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模，結(jié)果顯示(圖6):‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’泛變應(yīng)原蛋白Api g 4 與Hevb8 在蛋白質(zhì)核心區(qū)域的氨基酸序列相似性分別為78.2 %和78.9 %，比對(duì)參數(shù)分別為E-value=8e-60 和E-value=3e-60。‘津南實(shí)芹’的Api g 4 蛋白與‘美國(guó)西芹’的Api g 4 蛋白有2 個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，二者具有相似的三維空間結(jié)構(gòu)，均具有 3 個(gè) α 螺旋和 7 個(gè) β 折疊。

圖4 基于泛變應(yīng)原氨基酸序列的2 個(gè)芹菜品種及其他植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of two cultivars of Apium graveolens Linn.and other species basis on amino acid sequences of panallergens

圖5 ‘津南實(shí)芹’Api g 4 基因編碼的氨基酸序列的疏水性(A)和親水性(B)Fig. 5 Hydrophobicity (A)and hydrophilicity (B)of amino acid sequence encoded by Api g 4 gene from Apium graveolens‘Jinnanshiqin’

2.5 芹菜不同組織中Api g 4 基因的表達(dá)分析

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)Api g 4 基因在‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7 可見(jiàn):Api g 4 基因在‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’根中的表達(dá)水平均最高，在2 個(gè)品種的莖和莖尖分生組織中的表達(dá)水平相對(duì)較低，在葉中的表達(dá)水平很弱。由2 個(gè)品種間的比較可見(jiàn):Api g 4 基因在‘美國(guó)西芹’莖中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于‘津南實(shí)芹’莖;在‘美國(guó)西芹’莖尖分生組織中的相對(duì)表達(dá)量則低于‘津南實(shí)芹’，由此可見(jiàn)，Api g 4 基因的表達(dá)水平在2 個(gè)品種間具有一定的組織特異性。

圖6 2 個(gè)芹菜品種Api g 4 蛋白的三維結(jié)構(gòu)建模Fig. 6 The three-dimensional structural model of Api g 4 protein from two cultivars of Apium graveolens Linn.

圖7 2 個(gè)芹菜品種不同組織中Api g 4 基因相對(duì)表達(dá)量的比較Fig. 7 Comparison of relative expression amount of Api g 4 gene in different tissues of two cultivars of Apium graveolens Linn.

3 討 論

變態(tài)反應(yīng)(也稱過(guò)敏反應(yīng))是指機(jī)體受到抗原物質(zhì)刺激時(shí)發(fā)生的一類特殊免疫反應(yīng)［18］。泛變應(yīng)原能夠引起過(guò)敏病人發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致身體組織損傷和免疫功能紊亂［19］。開(kāi)展對(duì)泛變應(yīng)原的研究、尋找可能引起過(guò)敏反應(yīng)的抗原決定簇的氨基酸序列，能夠?yàn)閺姆肿铀缴细纳苹蛐揎椬儜?yīng)原提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用的‘津南實(shí)芹’是中國(guó)本土培育的品種，而另一品種‘美國(guó)西芹’來(lái)源于美國(guó)，二者雖然起源不同，但在外部形態(tài)上有一定的相似性。從‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’中獲得的Api g 4 基因有3 個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異，其編碼的氨基酸序列有2 個(gè)位點(diǎn)的差異，這些差異可能與某些特定的生理功能有關(guān)。

2 個(gè)芹菜品種Api g 4 基因主要在根中表達(dá)，在莖和莖尖分生組織中的表達(dá)量相對(duì)較低，在葉中表達(dá)很弱;另外，Api g 4 基因在‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’莖和莖尖分生組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)相反的規(guī)律，可見(jiàn)該基因的表達(dá)具有較明顯的種類及組織特異性。Api g 4 基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有重要作用，其表達(dá)特點(diǎn)可能與泛變應(yīng)原Api g 4 在植物體內(nèi)參與不同的生理過(guò)程有關(guān)。芹菜體內(nèi)包含的能誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原較多，過(guò)敏機(jī)制也較為復(fù)雜，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)也可能是過(guò)敏原間相互作用的結(jié)果。

氨基酸序列同源性及進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示:‘津南實(shí)芹’和‘美國(guó)西芹’的Api g 4 蛋白與其他植物的泛變應(yīng)原氨基酸序列高度保守，同源性很高。這些泛變應(yīng)原含有較多連續(xù)相同的氨基酸片段，推測(cè)這些片段可能為潛在的抗原決定簇，能夠引發(fā)機(jī)體的過(guò)敏反應(yīng)。在進(jìn)化樹(shù)上2 個(gè)芹菜品種與其同科植物歐芹和胡蘿卜歸于同一個(gè)進(jìn)化分支，在進(jìn)化上具有相對(duì)較近的關(guān)系，這一結(jié)果也為探討傘形科植物的親緣關(guān)系提供了佐證。此外，從進(jìn)化樹(shù)上可知:來(lái)源于不同種類的泛變應(yīng)原序列遺傳距離較近，表明不同種類間泛變應(yīng)原蛋白的進(jìn)化關(guān)系較近。據(jù)此推測(cè)高等植物中的泛變應(yīng)原蛋白可能是由共同的祖先蛋白進(jìn)化而來(lái)的，并且是高等植物中廣泛存在的一類重要蛋白。

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