李耀林周 藝，2何愛(ài)桃，2唐雙陽(yáng)王 蓉萬(wàn)艷平，*

（1 南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001；2 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；3 南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001）

Daxx-C626-740原核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

李耀林1周 藝1，2何愛(ài)桃1，2唐雙陽(yáng)1王 蓉3萬(wàn)艷平1，3*

（1 南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001；2 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；3 南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001）

目的 為了研制Daxx-C抗體并觀察其在宮頸癌細(xì)胞中的應(yīng)用效果，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a/DM626-740，將其在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物，鑒定其抗原性。方法 用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特異性引物，引入BamHI和SalI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增目的基因。將PCR產(chǎn)物連入載體pMD18-T，構(gòu)建pMD18-T/DM626-740；然后，將BamHI和SalI酶切產(chǎn)物連入載體pET28a，經(jīng)酶切鑒定及DNA序列分析后，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a/DM626-740。將其轉(zhuǎn)化E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni瓊脂糖凝膠層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物，Western-blot檢測(cè)表達(dá)物與純產(chǎn)物。結(jié)果 雙酶切和DNA測(cè)序結(jié)果顯示，PCR正確擴(kuò)增了Daxx-C基因片段并成功連入載體pET28a，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a/DM626-740；該質(zhì)粒在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)分子量約19kDa目的蛋白，且該蛋白能被抗Daxx抗體檢出。結(jié)論 構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a/DM626-740能在E.coli中表達(dá)目的的蛋白6His-DM626-740，并具有良好的抗原性。

Daxx；表達(dá)；純化；抗原性

20世紀(jì)90年代末期，Yang等[1]研究者發(fā)現(xiàn)了死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（death domain associate protein，Daxx）。Daxx是一種高度保守的蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，由740個(gè)氨基酸組成，包括1個(gè)富含絲氨酸/脯氨酸/蘇氨酸（S/P/T）、1個(gè)富含酸性氨基酸和2個(gè)雙螺旋四個(gè)結(jié)構(gòu)域，與Daxx發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用關(guān)系密切[2]。同時(shí)，Daxx定位與功能有關(guān)，它可定位到胞質(zhì)、胞膜、核質(zhì)、核仁和早幼粒細(xì)胞白血病蛋白（Promyelocyticleukemia protein，PML）核體（PML nuclear bodies，PML-NBs）等結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮不同的效應(yīng)。Daxx在某些因素影響下，通過(guò)修飾或是與其他蛋白質(zhì)相互作用后在亞細(xì)胞區(qū)室之間發(fā)生轉(zhuǎn)位，影響細(xì)胞周期，發(fā)揮抗病毒、促凋亡或抗凋亡、以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)作用[3]。在某些病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，病毒蛋白能與Daxx發(fā)生相互作用，破壞Daxx與PML共定位，從而使PML-NBs失去正常形態(tài)，如成散在的斑點(diǎn)狀。此時(shí)，PML-NBs將不能發(fā)揮抗感染作用，病毒處于潛伏感染狀態(tài)[4]。在全球女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率僅僅少于乳腺癌，居第二位，且80%集中在發(fā)展中國(guó)家，并有年輕化的趨勢(shì)[5]。在宮頸癌組織中，99.7%以上可以發(fā)現(xiàn)有人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）基因，它是致癌的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，HPV衣殼蛋白L2能誘導(dǎo)PML-NBs重組，增加Daxx的聚集，且與PML、Daxx發(fā)生共定位[6]。另外，HPVE1、E2、E5、E6、E7和L1均與PML-NBs有關(guān)系，PML-NBs很可能是HPV感染的始發(fā)部位[3]。因此，PML-NBs內(nèi)的Daxx在細(xì)胞內(nèi)防御病毒感染中具有非常重要的作用。本研究通過(guò)構(gòu)建Daxx-C原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化產(chǎn)物Daxx-C，為進(jìn)一步免疫小鼠制備特異性抗體，將抗體初步應(yīng)用于宮頸癌組織或細(xì)胞，分析Daxx在細(xì)胞中的分布與定位奠定前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本研究所保存有質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/Daxx[7]、菌株E.coli JM109及BL21；質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA純化回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品，兔抗Daxx Ab為Santa Cruz公司產(chǎn)品，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體（二抗）為碧云天生物工程公司產(chǎn)品；Ni瓊脂糖凝膠層析柱系Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建

根據(jù)Daxx全基因序列，運(yùn)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)Daxx-C626-740P1與P2引物，分別含BamHI或SalI雙酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)性堿基。引物由上海invitrogen公司合成。引物序列為（下劃線GGATCC為BamHI酶切位點(diǎn)，GTCGAC為SalI酶切位點(diǎn)）：P1 TATGGATCCAT GGGTCCCCCCTGCAAAAAATCTG；P2 ACGCGTCGACCTAATCAG AGTCTGAGAGCACGATCTC。PCR擴(kuò)增Daxx DM626-740片段。回收PCR產(chǎn)物后，將其連入載體pMD18-T，送南京金斯瑞公司進(jìn)行DNA序列分析。將pET28a/DM626-740經(jīng)BamHI和SalI雙酶切后，回收的小片段連入載體pET28a相同的位點(diǎn)，篩選陽(yáng)性克隆，構(gòu)建原核細(xì)胞表達(dá)載體pET28a/DM626-740，提質(zhì)粒備用。

1.2.2 6His-DM626-740融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將質(zhì)粒pET28a/DM626-740轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)菌。挑取單個(gè)菌落，用5mL LB（含50μg/mL卡那霉素）于37℃培養(yǎng)4h，添加0.5mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h；分別取800μL菌液于8000rpm離心5min，沉淀物用80μLPBS重懸；加入20μL上樣緩沖液混勻，取10μL進(jìn)行SDS-PAGE（12%）。大批量誘導(dǎo)表達(dá)菌，離心收集菌體，用20mL的50mmol/L PBS（pH 7.4）懸浮后超聲破碎菌體（超聲3s，間隔5s，超聲破碎100次）；離心超聲后的菌體，包涵體用20mL的50mmol/L PBS重懸，上清和包涵體分別進(jìn)行12%SDS-PAGE。將收集的上清液，用0.45μm濾膜過(guò)濾，濾過(guò)液過(guò)5mLNi瓊脂糖凝膠層析柱，按說(shuō)明書(shū)洗脫并收集洗脫液，純化后樣品用20 mmol/L PBS（pH 7.4）緩沖液透析去除咪唑，冷凍干燥保存。12%SDS-PAGE檢測(cè)純化物。

1.2.3 6His-DM626-740融合蛋白抗原性檢測(cè)（Western blot）

將誘導(dǎo)表達(dá)6His-DM626-740蛋白的菌株培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)膜，兔抗His單克隆抗體用含1%脫脂奶粉的PBS以1∶5000稀釋，將NC膜孵育其中，37℃，lh；將NC膜置于加入0.05%吐溫20的PBS中洗滌15min，每3min換1次液；同法將稀釋好的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG與NC膜孵育，37℃，1h；將NC膜置于加入0.05%吐溫加的PBS中洗滌5min，每3min換1次液；將膜放在等體積比配制的ECL檢測(cè)試劑混合液中孵育約5min，在暗室中用X線曝光1min，顯影、定影、漂洗。

2 結(jié) 果

2.1 pET28a/DM626-740載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增目的片段，連入載體pMD18-T，DAN測(cè)序結(jié)果完成正確后（結(jié)果未顯示），將其經(jīng)BamHI和SalI雙酶切的小片段連入載體pET28a，篩選得到陽(yáng)性克隆，其質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR，獲得約350 bp的目的條帶，大小與預(yù)期相符（圖1 lane2）。將質(zhì)粒用BamHI和SalI雙酶切得到約350 bp的小片段，大小與DM626-740一致（圖1 lane1），大片段與載體pET28a大小相符。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a/DM626-740PCR和酶切鑒定結(jié)果

2.2 融合蛋白6His-DM626-740的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心后重懸沉淀，12%SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖2。在分子量約19kDa處有表達(dá)產(chǎn)物（圖2 lane2～lane5），與預(yù)期6His-DM626-740蛋白質(zhì)分子量一致。將上清液和包涵體進(jìn)行12% SDSPAGE檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。融合蛋白6His-DM626-740主要以可溶性蛋白的形式存在于細(xì)胞破碎后的上清液中（圖3 lane2）。收集純化中每步的洗脫液、以及純化后的樣品用20mmol/L PBS（pH 7.4）緩沖液透析去除咪唑后，進(jìn)行SDS-PAGE（12%）檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖2 6His-DM626-740融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖3 6His-DM626-740融合蛋白表達(dá)部位鑒定

圖4 6His-DM626-740融合蛋白的純化與鑒定

2.3 融合蛋白6His-DM626-740的鑒定

Western blot檢測(cè)IPTG誘導(dǎo)菌及融合蛋白6His-DM626-740純化物，在19kDa 附近出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與預(yù)期融合蛋白6His-DM626-740分子量大小一致（圖5）；即所制備的融合蛋白作為抗原，能與抗Daxx抗體結(jié)合。

圖5 融合蛋白6His-DM626-740的Western blot分析

3 討 論

Daxx可能與病毒的感染、復(fù)制、增殖和細(xì)胞轉(zhuǎn)化存在密切的關(guān)聯(lián)[8]。在脾淋巴細(xì)胞，磷酸化的Daxx與PML結(jié)合發(fā)生相互作用，作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子通過(guò)影響細(xì)胞基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。Daxx的4個(gè)結(jié)構(gòu)域與Daxx的抗凋亡、促凋亡及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)功能密切相關(guān)。其中，DaxxC端是與其他蛋白質(zhì)相互作用及其發(fā)揮功能的主要部位[2]，如漢坦病毒核衣殼蛋白可與DaxxC末端兩個(gè)富含賴氨酸部位結(jié)合，其中一個(gè)部位與Daxx核定位信號(hào)的基序重疊[10]。通過(guò)Daxx C末端雙螺旋結(jié)構(gòu)域，HCMV UL82基因的表達(dá)產(chǎn)物pp71能直接結(jié)合Daxx，導(dǎo)致Daxx降解，抵消細(xì)胞內(nèi)Daxx形成的免疫防御作用，從而有助于病毒IE基因的表達(dá)，提高病毒感染性，并且加速病毒的感染周期[11]?？傊?，Daxx C端可以作為抗原成分，用來(lái)制備與Daxx結(jié)合的相應(yīng)特異性抗體。本研究構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a/DM626-740，并在E.coli中利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白6His-DM626-740，將其純化得其純化物。通過(guò)Western blot方法，利用商用Daxx抗體能夠檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，說(shuō)明6His-DM626-740蛋白能夠與抗Daxx抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合反應(yīng)。最近，有研究者在呼腸病毒感染的腦組織，發(fā)現(xiàn)通過(guò)IFN-I機(jī)制上調(diào)Daxx，可能依賴Daxx定位胞質(zhì)或胞核而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[12]，說(shuō)明Daxx定位與病毒感染后宿主細(xì)胞凋亡作用有關(guān)?？傊瑸榱擞^察在HPV16致宮頸癌進(jìn)程中Daxx在細(xì)胞內(nèi)位置的變化，接下來(lái)課題組會(huì)將純化的融合蛋白6His-DM626-740免疫小鼠，制備抗Daxx-C抗血清并進(jìn)行純化，通過(guò)免疫組化技術(shù)，將其初步應(yīng)用于宮頸癌組織或?qū)m頸癌細(xì)胞，進(jìn)一步確定相應(yīng)抗體的特異性。

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Construction and Induced Expression of Prokaryotic Expression Vector of Daxx-C626-740

LI Yao-lin1, ZHOU Yi1,2, HE Ai-tao1,2, TANG Shuang-yang1, WANG Rong3, WAN Yan-ping1,3*
(1 Institute of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421001, China; 2 School of Public Health, Nanhua University, Hengyang 421001,China; 3 College of Nursing, Nanhua University, Hengyang 421001, China)

Objective To prepare Daxx-C antibody and study its used effect on the cervical carcinoma, prokaryotic expression vector of Daxx-C626-740 was constructed and transformed into E.coli, and antigenicity of Daxx-C626-740 purified production was identified. Methods The specific primers of Daxx gene fragment(amino acids 626-740)including BamHI and SalI enzyme sites were esigned by software PRIMER5.0. PCR amplification products were inserted into MD18-T, and the vector of pMD18-T/DM626-740 was constructed. Then, DM626-740 gene fragments from pMD18-T/DM626-740 digested with BamHI and SalI were inserted into pET28a. The prokaryotic expression vector of pET28a/DM626-740 was constructed by identification of enzyme digestion and DNA sequence. The plasmid of pET28a/DM626-740 was transformed into E. coli BL21. The expression productions were induced with IPTG and purified by Ni-NTA kit. Western bolt was used to analyze expression and purification productions. Results The enzyme digestion and DNA sequencing results showed that Daxx gene fragment(626-740 amino acid residues)was correctly inserted into pET28a. The vector of prokaryotic expression vector of pET28a/DM626-740 was constructed. Conclusion The prokaryotic expression vector of pET28a/DM626-740 constructed can express the aim protein of 6His-DM626-740.The fusion protein of 6His-DM626-740 showed Daxx antigenicity.

Daxx; Expression; Purification; Antigenicity

R373

B

1671-8194（2013）35-0001-03

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（11A102）；湖南省教育廳一般項(xiàng)目（12C0337）；衡陽(yáng)市科技局項(xiàng)目（2011KJ2）

*通訊作者：E-mail： 365054993@qq.com