周 瀛 吳桂平* 遲 倩 張繼紅 畢 茹

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng)110001）

低氧對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HIF-1α表達(dá)影響的研究

周 瀛 吳桂平* 遲 倩 張繼紅 畢 茹

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng)110001）

目的通過體外不同氧濃度下培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，RT-PCR方法檢測(cè)，觀察正常氧濃度和低氧濃度對(duì)HIF-1α（缺氧誘導(dǎo)因子-1α）表達(dá)的影響。方法分離雄性Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，鑒定其CD34、CD44的表達(dá)，分為正常氧濃度組和低氧濃度組培養(yǎng)24h，RT-PCR方法檢測(cè)，不同氧濃度對(duì)細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響。結(jié)果貼壁法培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD44，不表達(dá)CD34；正常氧濃度培養(yǎng)的細(xì)胞較少有HIF-1α的表達(dá)，低氧濃度培養(yǎng)的細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)明顯增加。結(jié)論細(xì)胞低氧可激活HIF-1α的表達(dá)，低氧濃度培養(yǎng)的細(xì)胞的HIF-1α表達(dá)較正常氧濃度培養(yǎng)的細(xì)胞的表達(dá)明顯增加。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞低氧；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

冠心病以及各種心肌病所致的心臟損傷最終都會(huì)導(dǎo)致有功能的心肌細(xì)胞大量喪失，最終發(fā)生心力衰竭的不良結(jié)果，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心力衰竭已被證實(shí)是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ男碌闹委熜牧λソ叩姆椒╗1，2]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前需要體外培養(yǎng)，培養(yǎng)的條件對(duì)于細(xì)胞移植后的效果尤為重要，因此本研究通過體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在不同的氧條件下，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞通過RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察HIF-1α表達(dá)的改變，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前培養(yǎng)條件的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量130～150g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2 主要試劑

DMEM（低糖型）培養(yǎng)液（Hyclone公司），RT-PCR試劑盒（TAKARA公司），Trizol（上海生工），兔抗鼠CD34，CD44，（武漢博士德），免疫組化超敏S-P工作液試劑盒，DAB顯色試劑盒（福州邁新）。

1.3 BMMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

將Wistar大鼠用10%水合氯醛行腹腔麻醉，75%乙醇消毒后移入超凈臺(tái)，剝離雙后肢皮膚，剪斷髖關(guān)節(jié)，逐層剝離肌肉，剪斷脛、股骨干骺端，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗髓腔，篩網(wǎng)過濾，離心后棄上清，加PBS混懸離心2次后加入DMEM培養(yǎng)液，充分進(jìn)行吹打，接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃CO2培養(yǎng)箱中溫育，24h后換液一次，以后每隔3～4d換液一次，除去不貼壁的造血干細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。將傳至一代的BMMSCs細(xì)胞，接種在蓋玻片上，用于組織化學(xué)染色鑒定CD34、CD44。鑒定時(shí)以純丙酮室溫固定后滴加過氧化氫，PBS清洗滴加血清封閉液，一抗4℃過夜。余下步驟按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 細(xì)胞分組培養(yǎng)及RT-PCR檢測(cè)

BMMSCs細(xì)胞傳至一代后培養(yǎng)3d，可見細(xì)胞貼壁充分伸展，分為正常氧培養(yǎng)組（5%CO2）和低氧培養(yǎng)組（94% N2∶5% CO2∶1%O2）置于37℃CO2培養(yǎng)箱中溫育24h，通過RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)。采用Trizol一步法提取細(xì)胞中的總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。引物（大連寶生工有限公司合成）序列為：5’TTAGAGTCAAGCCCAGAG 3’；5’GGTAGAAGGTGGAGATGC3’。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化鑒定結(jié)果

傳代后的BMMSCsCD34染色為陰性，表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿不染色，細(xì)胞胞核染成藍(lán)色（圖1）；CD44染色陽(yáng)性，細(xì)胞胞漿染色為淡棕黃色，細(xì)胞胞核染色為藍(lán)色（圖2）；證實(shí)傳至一代的細(xì)胞為BMMSCs，不是造血干細(xì)胞。

圖1 BMMSCs CD34-×200

圖2 BMMSCs CD44+×200

2.2 RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)

見圖3。

3 討 論

本研究顯示，正常培養(yǎng)的細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)很少，而低氧條件培養(yǎng)下的細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)顯著增加[3]。組織細(xì)胞為了適應(yīng)環(huán)境缺氧，會(huì)激活氧敏感性轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1即為氧敏感性轉(zhuǎn)錄因子，其由β亞基和α亞基組成，β亞基為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性亞基，α亞基為氧依賴性亞基，其中α亞基是HIF-1的活性亞基和氧調(diào)節(jié)亞基。HIF-1α結(jié)構(gòu)中包含氧依賴降解結(jié)構(gòu)域（oxygen dependent degradation domain，ODD） 和反式活化結(jié)構(gòu)域（trans-activation domain，TAD），后者參與轉(zhuǎn)錄活化，前者控制其常氧環(huán)境中的降解[4]可以防止組織細(xì)胞受損、抑制細(xì)胞的凋亡和維持機(jī)體內(nèi)氧的穩(wěn)態(tài)[5]。

圖3 RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)M Marker；低氧培養(yǎng)的BMMSCs；2正常氧濃度培養(yǎng)的BMMSCs

缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α是哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)為適應(yīng)缺氧而存在的非常重要的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)靶基因，從而調(diào)節(jié)血管的張力、調(diào)節(jié)心血管因缺血而發(fā)生的功能障礙等一系列生理和病理生理過程。目前已經(jīng)知道的HIF-1α調(diào)控基因包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、糖酵解酶、血紅素氧合酶-1（HO-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（GLUT-1）和3、酪氨酸羥化酶、腎上腺髓質(zhì)素等。以上基因的表達(dá)產(chǎn)物涉及機(jī)體內(nèi)多種缺氧反應(yīng)的調(diào)節(jié)，包括血管的發(fā)生、塑型及收縮，紅細(xì)胞的生成、能量代謝的改變和調(diào)節(jié)[6-8]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植將成為治療心力衰竭的一種很有潛力的新方法，其與基因工程的結(jié)合必將成為臨床治療心力衰竭的未來發(fā)展方向。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在移植入宿主體內(nèi)后需經(jīng)歷局部的低氧環(huán)境，在適應(yīng)宿主體內(nèi)低氧的環(huán)境過程中，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）的表達(dá)會(huì)相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致HIF-1調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而使下游VEGF轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)血管的生成。因此轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的表達(dá)增加能夠明顯加速宿主機(jī)體內(nèi)血管的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)移植細(xì)胞的成活，改善心室重塑[9]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前需要體外培養(yǎng)，如果能夠通過對(duì)培養(yǎng)條件改變的研究，使細(xì)胞移植后的效果更為理想，就顯得尤為重要。本研究通過體外低氧培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前的培養(yǎng)條件的研究提供理論依據(jù)。未來將對(duì)低氧培養(yǎng)的細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)及移植入宿主體內(nèi)后，對(duì)細(xì)胞成活率及新生血管生成的影響進(jìn)一步研究。

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The Study of HIF-1α Expression on Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells by Hypoxia

ZHOU Ying, WU Gui-ping*, CHI Qian, ZHANG Ji-hong, BI Ru

(Department of Cardiology, Shenzhou Hospital, Shenyang Medical College, Shenyang 110001, China)

ObjectiveTo study the expression of HIF-1αusing RT_PCR method on rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSCs) by different culture oxygen concentration in vitro.MethodsBMMSCs from adult wistar rats were cultured and evaluated the expressed of surface markers, including CD34, CD44.After the first generation, BMMSCs were culture by normal oxygen and hypoxia,after 24 hours, RT-PCR was used to evaluate the different expression of HIF-1α.ResultThe cells by anchoring culture expressed CD44, not CD34; less HIF-1α expression on normal oxygen group but significant more expression of HIF-1α on hypoxia group.ConclusionCell hypoxia can stimulate the expression of HIF-1α, the expression of HIF-1α is significant more in hypoxia group than normal oxygen group.

Bone marrow mesenchymal stem cell; Cell hypoxia; HIF-1α

R541.4

B

1671-8194（2013）15-0023-03

*通訊作者：E-mail： wuguiping66@126.com