劉永峰, 高俊嶺, 徐 陽, 冉仁森

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine-3′,5′-monophosphospate,cAMP),溶于水,具有環(huán)狀結(jié)構(gòu),性質(zhì)穩(wěn)定,對(duì)酸、堿、熱都相當(dāng)穩(wěn)定,存在于多數(shù)生物體內(nèi),調(diào)節(jié)著生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝,對(duì)細(xì)胞代謝及多種生理效應(yīng)具有關(guān)鍵作用[1-2].醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)也證明至少有40多種重大疾病與cAMP的代謝有關(guān),人體內(nèi)缺乏cAMP會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤、癌癥、失眠健忘、貧血、心血管疾病等眾多疾病的發(fā)生[3].目前,對(duì)于食品及食品原料中cAMP的研究,僅在棗中取得了一定的進(jìn)展.張明娟等[4]用 HPLC法測定了8種棗果中cAMP的含量,其最高含量為375.61μg/g,最低為46.01μg/g;張巖等[5]用 HPLC測定濃縮棗汁中cAMP含量為4.556 mg/L.馬志科等[6]報(bào)道了從鮮羊奶中提取cAMP的方法,并利用放射免疫方法測定了cAMP含量,但有關(guān)牛奶中的cAMP研究尚未見有相關(guān)報(bào)道.

牛奶中的蛋白質(zhì)主要由酪蛋白和乳清蛋白組成,蛋白質(zhì)含量為3.0% ～3.7%,其中約80%為酪蛋白(酪蛋白至少由10種不同蛋白質(zhì)組成,是幾種含磷蛋白質(zhì)的復(fù)合體),乳清蛋白為18% ～20%,乳中主要的乳清蛋白有β-乳球蛋白、α-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和眎、胨;剩余的為一些含氮化合物,屬于非蛋白氮(如氨、游離氨基酸、尿素、尿酸、肌酸、嘌呤堿等及少量含氮維生素中的維生素態(tài)氮)[7].通過標(biāo)準(zhǔn)羅蘭分離法測定,牛乳中氮分布為76%的酪蛋白、18%乳清蛋白和5%左右的非蛋白氮[8].在生物化學(xué)、食品科學(xué)及其他研究領(lǐng)域中,人們經(jīng)常用到蛋白或多肽的沉淀劑,其中三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)應(yīng)用最為廣泛[9].TCA對(duì)蛋白的沉淀主要?dú)w功于3個(gè)氯原子的獨(dú)特作用[10],TCA作為蛋白質(zhì)變性劑,使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變,暴露出較多的疏水基團(tuán),使之聚集沉淀[11].因此,本實(shí)驗(yàn)借鑒前人在棗、羊奶上的提取和測定方法,首次采用TCA沉淀蛋白法對(duì)牛奶中的cAMP進(jìn)行分離提取,通過HPLC測定牛奶中cAMP含量,建立一種牛奶中cAMP分離提取方法.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

新鮮牛乳,購于陜西省西安市郊農(nóng)戶家中,于4℃條件下冷藏保存,至實(shí)驗(yàn)使用.

cAMP標(biāo)準(zhǔn)品,色譜純,德國Sigma公司;甲醇,色譜純,加拿大Promptar公司;三氯乙酸、磺基水楊酸、乙醇、磷酸二氫鉀均為分析純.

1.1.2 儀器

高效液相色譜儀,美國Waters公司;色譜柱,HC-C18(5μm,4.6 mm×250 mm),美國Agilent公司;TU-2000型紫外可見分光光度計(jì),日本日立公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;D5-RZ型離心機(jī)型,湖南湘儀集團(tuán).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品去乳脂

將300 mL鮮乳使用醫(yī)用紗布過濾,分裝至20個(gè)離心管,預(yù)熱至35～40℃,然后5 000 r/min,離心10 min,取下層去脂后的牛奶,混合.

1.2.2 樣品去乳蛋白

將去脂后的牛奶,裝在27個(gè)15 mL離心管中,每管10 mL.分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,15%,20%的TCA溶液處理,每個(gè)離心管中分別加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA 4,6,8 mL,35℃沉淀10 min后,1 000 r/min,離心10 min,取上清液1滴,放入黑色比色板孔中,加1滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%磺基水楊酸檢測,如出現(xiàn)白色沉淀,證明還有蛋白質(zhì)存在,繼續(xù)沉淀、離心,直到無白色沉淀為止,過濾,取無色上清液分別至27個(gè)離心管中.

1.2.3 樣品去乳糖

將27個(gè)離心管中去蛋白后的濾液的分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,75℃濃縮,將提取液濃縮到占初濾液體積1/10～1/15時(shí),冷卻濃縮液至20℃,保持?jǐn)?shù)小時(shí),然后放入4℃的冰箱過夜,形成乳糖結(jié)晶于容器底部.取上清液于1.5 mL的離心管中,離心5 min,取上層液體,即為 cAMP溶液,并稱重液體質(zhì)量.

1.2.4 cAMP的HPLC測定

取cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液,對(duì)其進(jìn)行紫外全波長掃描,根據(jù)最大吸收率,確定其檢測波長為259 nm.本研究流動(dòng)相的選擇參考張倩等[12]采用的方法,對(duì)cAMP進(jìn)行定性.HPLC測定牛奶中cAMP含量的色譜條件為流動(dòng)相采用V(甲醇)∶V(雙蒸水)=10∶90,其中雙蒸水中磷酸二氫鉀的濃度為0.05 moL/L.檢測波長為259 nm,色譜柱為HC-C18柱,流速1.0 mL/min,檢測溫度為室溫,進(jìn)樣量為20μL;采用保留時(shí)間法定性[13],出峰時(shí)間為3.4 min.

1.2.5 樣品中cAMP含量的測定及統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)TCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平和3個(gè)TCA用量水平,共9個(gè)處理,每個(gè)處理3次重復(fù).每個(gè)樣品溶液分別過0.45μm濾膜,進(jìn)樣進(jìn)行HPLC測定.

根據(jù)式(1),計(jì)算出每個(gè)樣品中cAMP的質(zhì)量濃度.

式(1)中v為制備樣品溶液濃縮后的體積,mL;c為HPLC測定樣品溶液中cAMP質(zhì)量濃度,μg/mL;v1為制備樣品溶液所用牛奶的體積mL.

每個(gè)樣品中cAMP質(zhì)量濃度在不同處理下分別計(jì)算,所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素9水平方差分析,并進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中cAMP的色譜圖

樣品cAMP的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖分別為圖1和圖2.圖1表明,樣品中 cAMP保留時(shí)間為3.374 min,而圖2中標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為3.389 min,所有樣品中cAMP保留時(shí)間均與cAMP標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致,并且樣品中的目標(biāo)峰與其他峰分離效果都較好.推測其他峰有可能是環(huán)鳥苷酸、明膠等物質(zhì).

圖1 樣品溶液中cAMP的色譜圖Fig.1 Chromatogram of cAMP in sample solution

2.2 樣品中cAMP質(zhì)量濃度的測定

圖2 cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of cAMP in standard solution

TCA處理牛奶樣品溶液中cAMP質(zhì)量濃度的測定結(jié)果見表1和圖3.可知,不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA處理組之間比較,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%TCA處理組cAMP質(zhì)量濃度顯著高于其他2個(gè)組(P＜0.05).不同用量相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA處理組之間比較,8 mL TCA處理組cAMP質(zhì)量濃度較其他兩組顯著降低(P＜0.05),而4 mL和6 mL處理組之間的cAMP質(zhì)量濃度差異不顯著(P＞0.05).不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)且不同用量的TCA處理組之間比較,發(fā)現(xiàn)4 mL和6 mL 10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA處理樣品時(shí),cAMP質(zhì)量濃度為最高(P＜0.05),如圖4;其次是4 mL和6 mL 20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA處理樣品時(shí)cAMP質(zhì)量濃度;8 mL 15%質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA處理樣品時(shí)cAMP質(zhì)量濃度最低(P＜0.05).因此,牛奶中 cAMP分離提取時(shí),若選用TCA沉淀乳蛋白方法,最佳TCA處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,選擇用量為4～6 mL,盡量避免選用8 mL的TCA用量.選用10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA溶液處理優(yōu)于15%和20%質(zhì)量分?jǐn)?shù),可能是因?yàn)闈舛冗^高會(huì)破壞cAMP的生物學(xué)結(jié)構(gòu),造成cAMP含量減少.因此,綜合考慮,應(yīng)選擇4 mL 10%的三氯乙酸處理.

表1 牛奶樣品中cAMP質(zhì)量濃度的測定結(jié)果Tab.1 Determination results of cAMPcontents in milk samples-μg/mL

圖3 牛奶樣品中cAMP質(zhì)量濃度測定結(jié)果Fig.3 Determination results of cAMPcontents in milk samples

圖4 最佳TCA處理組合的樣品溶液色譜圖之一Fig.4 One chromatogram of sample solution obtained from processing combination of TCA

3 討論與結(jié)論

本研究通過離心去除乳中脂肪,采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同用量TCA沉淀乳中蛋白質(zhì),再濃縮乳糖,分離提取cAMP,選用HPLC測定了牛奶中cAMP質(zhì)量濃度.不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA處理組之間比較,10%TCA處理組cAMP質(zhì)量濃度顯著高于其他2個(gè)組(P＜0.05);不同用量相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA處理組之間比較,8 mL TCA處理組cAMP質(zhì)量濃度較其他兩組顯著降低(P＜0.05);不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)且不同用量的TCA處理組之間比較,4 mL和6 mL 10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)TCA處理樣品時(shí),cAMP質(zhì)量濃度為最高(P＜0.05).選用TCA沉淀乳蛋白方法提取牛奶中cAMP時(shí),4 mL 10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TCA最佳處理工藝測定cAMP質(zhì)量濃度為(29.02±1.58)μg/mL.

本研究工藝同樣適用于乳清、乳酪副產(chǎn)物、不合格原料牛奶.乳清是在制造奶酪時(shí),從牛奶中分離出來的液體部分,最主要成分就是乳蛋白.目前生產(chǎn)1 t干奶酪排放9 t乳清,每年世界上有上億t的乳清等待利用和處理,數(shù)量相當(dāng)大.而cAMP的獲得,一般采用人工合成方法,國內(nèi)僅有的幾家公司采用核糖核酸為原料生產(chǎn)cAMP,成本在12萬元/kg以上,國外廠家如Sigma公司cAMP生產(chǎn)成本高達(dá)178.5萬元/kg.本實(shí)驗(yàn)通過研究牛奶中cAMP的分離提取工藝,最終將建立一套cAMP提取工藝;該工藝的建立,為從乳清、乳酪副產(chǎn)物、不合格牛奶中提取cAMP提供了理論基礎(chǔ),從而將大大降低cAMP生產(chǎn)成本,變廢為寶,增加產(chǎn)品的附加值.

[1] 劉永峰,昝林森,田萬強(qiáng).外源性環(huán)核苷酸調(diào)控哈白兔血脂、血糖及血蛋白的動(dòng)態(tài)變化研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(14)：84-88.

[2] 高建林,李青南.第二信使cAMP、cGMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨形成的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2010,26(12)：1545-1549.

[3] 王立霞.和田玉棗cAMP口服液的研制[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·綜合刊,2010,36(4)：76-78.

[4] 張明娟,李薇,龐曉明.棗果中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的提取工藝及含量測定[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(5)：228-231.

[5] 張巖,呂品,王紅,等.高效液相色譜法同時(shí)測定濃縮棗汁中環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷的含量[J].食品科學(xué),2009,30(18)：321-322.

[6] 馬志科,昝林森,王倩,等.乳中環(huán)核苷酸提取方法研究[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1997,5(5)：36-39.

[7] 肖蓮榮,任國譜,張素文.雙縮脲比色法分析三氯乙酸沉淀乳蛋白效果探討[J].食品工業(yè)科技,2011,32(5)：415-417.

[8] 仇凱,鐘其頂,武金鐘,等.食品中牛乳蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)比研究[J].中國乳品工業(yè),2008,36(12)：47-49,52.

[9] 韓道財(cái),楊萍,洪鵬志.三氯乙酸沉淀羅非魚肉蛋白酶解液的液相色譜分析[J].食品工業(yè)科技,2012,33(9)：92-94,99.

[10] Sivaraman T,Kumar T K,Jayaraman G,et al.The mechanism of 2,2,2-trichloroacetic acid-induced protein precipitation[J].Journal of Protein Chemistry,1997,16(4)：291-297.

[11] 牛巍,侯彩云,祝曉芳,等.三氯乙酸沉淀法與硫酸銅沉淀法在液態(tài)奶蛋白質(zhì)檢測中適用性研究[J].中國乳品工業(yè),2008,36(9)：59-61.

[12] 張倩,樊君,羅云書.HPLC測定陜北大棗和新疆大棗中環(huán)磷酸腺苷含量的研究[J].藥物分析雜志,2008,28(6)：895-897.

[13] 史景江,熙中.色譜分析法[M].重慶：重慶大學(xué)出版社,1995.