羅保紅 劉振北 周仲民 劉峭梅

廣西壯族自治區(qū)血液中心，廣西 柳州 545005

使用BEPIII全自動(dòng)酶免分析儀，能提高實(shí)驗(yàn)室的工作效率和檢驗(yàn)質(zhì)量，減少由于人工操作所造成的誤差。但是，BEPIII在同時(shí)處理多塊酶標(biāo)反應(yīng)板實(shí)驗(yàn)時(shí)，常出現(xiàn)“堵車”現(xiàn)象，從而使ELISA酶標(biāo)反應(yīng)板在預(yù)孵室 (室溫)中滯留了過長(zhǎng)時(shí)間后才能正式進(jìn)入孵育室 (37℃)。本文通過實(shí)驗(yàn)，對(duì)滯留時(shí)間 (即預(yù)孵時(shí)間)的增加可能造成ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到的影響進(jìn)行探討，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 受檢標(biāo)本

1.1.1 抗－HIV標(biāo)本6份:第1份為陰性標(biāo)本，用陰性獻(xiàn)血員的血清混合配成;第2份為弱陽性標(biāo)本，用陰性獻(xiàn)血員的血清加入陽性標(biāo)本配成;第3份為陽性標(biāo)本，用陽性獻(xiàn)血員的血清混合配成;第4份為陰性對(duì)照，用抗－HIV試劑盒陰性對(duì)照混合配成;第5份為陽性對(duì)照，用抗－HIV試劑盒陽性對(duì)照混合配成;第6份為質(zhì)控血清，用2NCU/ml稀釋成低OD值血清。第1～3份標(biāo)本分別平行分裝到16支試管中，第4～6份則分別平行分裝到8支試管中。

1.1.2 抗－HCV標(biāo)本6份:第1份為陰性標(biāo)本 (×16);第2份為弱陽性標(biāo)本 (×16);第3份為陽性標(biāo)本 (×16);第4份為陰性對(duì)照 (×8);第5份為陽性對(duì)照 (×8);第6份為2NCU/ml質(zhì)控血清 (×8)。其配制方法與抗－HIV標(biāo)本類同。

1.2 儀器與試劑 RSP200全自動(dòng)加樣器 (瑞士TECAN公司);BEPIII酶免分析儀 (德國(guó)德靈公司);抗－HIV和抗－HCV ELISA試劑盒 (北京萬泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別是I20050404，C20050404);2NCU/ml抗 －HIV質(zhì)控血清(衛(wèi)生部臨檢中心);2NCU/ml抗－HCV質(zhì)控血清 (上海血液中心)。

1.3 方法

1.3.1 取出試劑并放置在溫度23℃，濕度68%的實(shí)驗(yàn)室平衡30分鐘。

1.3.2 為了減少板間差異，實(shí)驗(yàn)時(shí)用同一批號(hào)，并且分拆同一板的包被條來檢測(cè)同一份標(biāo)本和陰、陽性對(duì)照及質(zhì)控血清。1.3.3 用同一臺(tái)RSP200把72個(gè)標(biāo)本加到5塊ELISA抗－HIV酶標(biāo)反應(yīng)板中，置室溫中分別在 0、15、30、45、60min進(jìn)入同一臺(tái)BEPIII進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 抗－HCV的檢測(cè)方法與抗－HIV相同。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，測(cè)定結(jié)果用±s)表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為兩者差異顯著，P＜0.01為兩者差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 ELISA抗 －HIV酶標(biāo)反應(yīng)板在室溫 (23℃)、濕度68%條件下，分別放置0、15、30、45、60min后進(jìn)入BEPIII檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)后比較顯示:①陰性標(biāo)本15、45min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05。②弱陽性標(biāo)本30、45、60min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;30、45、60min結(jié)果分別與15min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05。③陽性標(biāo)本15、30、45、60min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;④陰性對(duì)照，30min結(jié)果與0min比較，兩者差異顯著，P＜0.05;⑤陽性對(duì)照，30、45、60min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑥質(zhì)控血清，15、30、45、60min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑦30、45、60min結(jié)果分別與15min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05。ELISA抗 －HIV酶標(biāo)反應(yīng)板放置時(shí)間越長(zhǎng)，各標(biāo)本的檢測(cè)值總體越大，見表1。

表1 ELISA抗－HIV檢測(cè)結(jié)果 (S/CO)及比較 ±S)

表1 ELISA抗－HIV檢測(cè)結(jié)果 (S/CO)及比較 ±S)

注:▲表示與0min比較，P＜0.05;★表示與15min比較，P＜0.05。

檢測(cè)樣本0.054±0.0086弱陽性標(biāo)本 16 2.17±0.16 2.25±0.18 3.19±0.27▲★ 3.53±0.31▲★ 3.86±0.29▲★陽性標(biāo)本 16 11.53±0.77 12.31±0.81▲ 15.91±1.69▲ 16.58±1.61▲ 18.33±1.71▲陰性對(duì)照 11 0.063±0.0082 0.070±0.0077 0.055±0.0072▲ 0.063±0.0093 0.070±0.0084陽性對(duì)照 9 22.93±1.86 24.69±2.12 26.71±2.48▲ 28.05±3.08▲ 28.65±3.72▲質(zhì)控血清 9 1.98±0.14 2.24±0.13▲ 3.02±0.23▲★ 3.25±0.28▲★ 3.85±0.29 0min 15min 30min 45 min 60min陰性標(biāo)本 16 0.055±0.0083 0.062±0.0099▲ 0.055±0.0077 0.070±0.0105▲n▲★

2.2 ELISA抗－HCV酶標(biāo)反應(yīng)板在室溫23℃、濕度68%條件下，分別放置0、15、30、45、60min后進(jìn)入BEPIII檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)后比較顯示:①陰性標(biāo)本60min結(jié)果與0min比較，兩者差異顯著，P＜0.05;②弱陽性標(biāo)本15、30、45、60min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P ＜0.05;③30、45、60min結(jié)果分別與15min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05。④陽性標(biāo)本15、30、45、60min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑤陰性對(duì)照，15、30min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑥陽性對(duì)照，30、45、60min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑦質(zhì)控血清，15、30、45、60min結(jié)果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑧30、45、60min結(jié)果分別與15min比較，均為兩者差異顯著，P ＜0.05。ELISA抗－HCV酶標(biāo)反應(yīng)板放置時(shí)間越長(zhǎng)，各標(biāo)本的檢測(cè)值總體越大，見表2。

表2 ELISA抗－HCV檢測(cè)結(jié)果 (S/CO)及比較 (±S)

表2 ELISA抗－HCV檢測(cè)結(jié)果 (S/CO)及比較 (±S)

注:▲表示與0min比較，P＜0．05;★表示與15min比較，P＜0.05。

0 min 15min 30min 45 min 60min陰性標(biāo)本 16 0.057±0.0120 0.050±0.0115 0.064±0.0166 0.057±0.0123 0.071±0.0178▲n弱陽性標(biāo)本 16 1.08±0.06 1.61±0.14▲ 1.89±0.13▲★ 2.13±0.19▲★ 2.23±0.17▲★陽性標(biāo)本 16 9.36±0.59 12.06±0.95▲ 15.36±1.45▲ 15.95±1.80▲ 16.38±1.70▲陰性對(duì)照 11 0.043±0.0090 0.057±0.0103▲ 0.057±0.0131▲ 0.036±0.0086 0.050±0.0110陽性對(duì)照 10 20.83±2.29 22.40±2.91 23.51±3.29▲ 24.72±3.11▲ 25.24±3.81▲質(zhì)控血清 9 5.43±0.33 7.31±0.52▲ 9.59±0.80▲★ 9.90±1.08▲★ 10.41±0.81▲★

3 討論

由表1可知:①對(duì)于低值陰性標(biāo)本和陰性對(duì)照，不同預(yù)孵時(shí)間對(duì)抗－HIV檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明，方差是齊的。但是，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，有與無并存，無多于有 (5比3)，且無規(guī)律性。估計(jì)與孔間非特異性結(jié)合的差異有關(guān)，沒有進(jìn)一步探討。②對(duì)于抗－HIV弱陽性標(biāo)本，室溫放置30min，其檢測(cè)結(jié)果是，方差是齊的，但是，結(jié)果有顯著性差異 (P＜0.05);往后時(shí)間，不單方差不齊，其結(jié)果的差異也越見明顯。③對(duì)于抗－HIV陽性標(biāo)本，室溫放置15min，其結(jié)果與正常相比，已有顯著差異 (P＜0.05);往后時(shí)間，其方差都是不齊的，且統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異更加顯著。④對(duì)于陽性對(duì)照，其方差都是齊的，估計(jì)是與抗體的高濃度有關(guān)。但是，室溫放置30min之后，結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也都有顯著差異。⑤對(duì)于低值質(zhì)控血清，其方差是齊的，但是，15min起，其結(jié)果就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，而且越往后越見顯著。⑥對(duì)于弱陽性標(biāo)本和低值質(zhì)控血清，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，③④⑤分別與②相比較，其結(jié)果都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。同時(shí)，隨著預(yù)孵時(shí)間的增加，④與③、⑤與④相比較，其差異性已呈明顯下降之勢(shì)，有的已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明此時(shí)血清抗體的滴度已相當(dāng)?shù)?，繼續(xù)預(yù)孵對(duì)提高試劑檢測(cè)的靈敏度不僅已無意義，而且增加了出現(xiàn)假陽性的機(jī)率。

由表2可知，ELISA抗－HCV檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，各標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與ELISA抗－HIV是類似的。不同的是前者對(duì)預(yù)孵時(shí)間的增加更為敏感。表現(xiàn)在:第一，對(duì)于弱陽性抗－HCV標(biāo)本，室溫放置15min起，方差不齊，且統(tǒng)計(jì)學(xué)意義都非常顯著。第二，對(duì)于2NCU/m l抗－HCV質(zhì)控血清，30min起方差不齊，15min起均數(shù)的差異就有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本次對(duì)抗－HIV和抗－HCV的弱陽性標(biāo)本、陽性標(biāo)本、陽性對(duì)照及質(zhì)控血清的檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明，隨著預(yù)孵時(shí)間的增加，方差由齊向不齊越見明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上則越見顯著。特別對(duì)于弱陽性標(biāo)本和低值質(zhì)控血清的影響更為突出。由兩表統(tǒng)計(jì)可見:一方面，若按CV值15%是實(shí)驗(yàn)室可接受的RCV范圍算，預(yù)孵15min后，與正常相比較，兩者S/CO值相差都在2SD左右，這是屬于失控范疇，也與資料的報(bào)道相符［1，2］;另一方面，由于預(yù)孵時(shí)間的延長(zhǎng)，使得標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的S/CO值顯著提高，這說明預(yù)孵時(shí)間的增加能一定程度地提高試劑的檢測(cè)靈敏度，這是有利于降低弱陽性標(biāo)本的漏檢率;再有，隨著預(yù)孵時(shí)間的增加，出現(xiàn)假陽性的機(jī)率在提高，這可能主要是因?yàn)闃?biāo)本所含的抗體量已相當(dāng)?shù)鸵约胺翘禺愋越Y(jié)合所致。為了確保臨床的用血安全，減少輸血后傳染病的發(fā)生率，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心早在2002年就要求各級(jí)血站必須認(rèn)真貫徹落實(shí)“檢驗(yàn)的全程質(zhì)控”［3］。這就要求我們對(duì)每一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都要充分估計(jì)及檢驗(yàn)其實(shí)驗(yàn)過程中每一個(gè)可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性有影響的因素。由于北京萬泰ELISA抗－HIV和抗－HCV第一步孵育時(shí)間都比較短(都是30min)，所以，預(yù)孵時(shí)間的增加對(duì)其結(jié)果的影響是比較大的［4］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，若科學(xué)合理地安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間和進(jìn)板順序，使得酶標(biāo)反應(yīng)板預(yù)孵時(shí)間在室溫中不超過15min，那么，不單能提高ELISA抗－HIV和抗－HCV的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，而且能有效地保證∕提高試劑檢測(cè)的靈敏度。

［1］朱遠(yuǎn)雁，余俊平，劉濤．加樣時(shí)差對(duì)獻(xiàn)血者HBsAg ELISA結(jié)果的影響［J］，中國(guó)輸血雜志，2002，15(4):239．

［2］張伯偉．酶免分析儀檢測(cè)抗－HCV結(jié)果的質(zhì)控分析［J］，中國(guó)輸血雜志，2004，17(5):356．

［3］鄭懷競(jìng)．必須做好各級(jí)血站實(shí)驗(yàn)室免疫學(xué)檢驗(yàn)的室內(nèi)全程質(zhì)量控制［J］。中國(guó)輸血雜志，2002，15(5):299．

［4］馮健亮，等．抗－HCV ELISA試劑在全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)的應(yīng)用［J］．中國(guó)輸血雜志，2002，15(5):342．