洪 軍，胡建業(yè)，牛亞菲，姬曉娜，趙安芳，王奕霞，黃瓊琳，李光耀

(河南城建學(xué)院生物工程系，河南 平頂山 467036)

抗生素藥物的濫用，導(dǎo)致了許多細(xì)菌、尤其是致病菌的抗藥性問題.耐藥性超強(qiáng)的“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)更加重了人們對抗生素使用的擔(dān)心，細(xì)菌的抗藥性已成為困擾21 世紀(jì)人類醫(yī)學(xué)、養(yǎng)殖業(yè)等發(fā)展的世界性難題，迫切需要產(chǎn)生一種新的抗菌藥物來替代抗生素.而抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物體抵御外源性病原微生物的入侵而產(chǎn)生的一類小分子多肽，因其抗菌譜廣且不易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，因而有望成為新一代抗菌藥物［1，2］.目前，它已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動植物、藥物開發(fā)、臨床治療、食品防腐劑和飼料添加劑等，顯示出良好的應(yīng)用與發(fā)展前景.鱟素(TachyplesinI)是1988年由NAKAMURA 等人從中國鱟血細(xì)胞的酸性提取物中分離出來的一種具有典型環(huán)狀β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽(AMPs)，它由17個氨基酸殘基構(gòu)成.研究發(fā)現(xiàn)，鱟素具有廣譜抗菌活性，可抑殺細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲，還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的作用［3～8］.因其潛在作用和較小的相對分子質(zhì)量，在醫(yī)藥、畜牧和食品等領(lǐng)域有望成為新一代的抗生素替代品［9～11］.在作者前期的研究中采用2種短期誘導(dǎo)方法，研究鱟素能否誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，結(jié)果表明，鱟素對大腸桿菌ATCC25922、致病性大腸桿菌F41和金黃色葡萄球菌ATCC25923 均未誘導(dǎo)出抗藥性［12］.紫外線、亞硝基胍、離子束輻射等理化因素均是微生物中常用的誘變劑，經(jīng)這些誘變劑處理的細(xì)菌能引起基因突變，更易導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生.當(dāng)紫外線直接照射細(xì)菌時，輻射引起正常DNA分子相鄰胸腺嘧啶分子彼此結(jié)合形成二聚體，從而可能獲得變異的抗藥菌株.關(guān)于誘變細(xì)菌對鱟素耐受性的研究目前尚屬空白.本研究以大腸桿菌JM109和ATCC25922為研究對象，通過紫外線誘變技術(shù)對原始菌株進(jìn)行誘變，以相應(yīng)的未誘變菌株作對照，并通過鱟素濃度梯度平板對大腸桿菌進(jìn)行初篩.一方面對初篩到的抗鱟素菌株進(jìn)行亞抑菌濃度鱟素的連續(xù)傳代誘導(dǎo)，觀察紫外線對大腸桿菌的生物學(xué)效應(yīng)及其鱟素對紫外線誘變的細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的難易程度;另一方面，通過抗生素對初篩到的抗鱟素菌株進(jìn)行敏感性測定，觀察抗生素與鱟素是否有交互抗性.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 供試菌株:大腸桿菌ATCC25922 由廣東省微生物保藏中心提供，大腸桿菌JM109 由河南城建學(xué)院生物工程系保存.抗菌劑:鱟素由吉爾化(上海)有限公司合成，純度為95%以上，合成的鱟素含有2個二硫鍵，分別位于Cys-3和Cys-16 及Cys-7和Cys-12 之間;鹽酸左氧氟沙星和氨芐青霉素，分別由康普藥業(yè)股份有限公司和江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司提供.

培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂、酵母膏、胰蛋白胨由北京奧博星生物技術(shù)有限公司提供;瓊脂糖由上海艾研生物科技有限公司提供;氯化鈉由洛陽市化學(xué)試劑廠提供;MH 肉湯由杭州天和微生物試劑有限公司提供.

1.1.2 主要儀器設(shè)備 HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，LRH-250F型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，DG5033A型酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司).

1.2 藥敏試驗

從斜面保存的菌種上挑取一環(huán)細(xì)菌，接種于滅菌三角瓶中的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃250 r·min-1恒溫?fù)u床上過夜培養(yǎng).第2天再按1∶100的菌液與培養(yǎng)基的比例轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至2～3 h，將培養(yǎng)后的菌液用MH 肉湯培養(yǎng)基稀釋成106個mL-1的菌懸液，向無菌的96 孔平板中的第1～11 列中各加入100μL 菌懸液，12 列不加菌液而加營養(yǎng)肉湯作為陰性對照.然后從1～10 列中逐一加入100μL 用新鮮MH 肉湯配制的抗菌肽(AMPs)，11 列作為陽性對照孔不加AMPs，37℃，90 r·min-1恒溫培養(yǎng)20 h.用DG5033A型酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm 下對平板進(jìn)行掃描，按照低于50%對照孔(11 孔)生長以上的最小質(zhì)量濃度計算抗菌劑的最小抑菌濃度(MIC)值［13］.

1.3 大腸桿菌的紫外線誘變

在菌種誘變前，先打開8W的紫外燈預(yù)熱30 min，使光波穩(wěn)定，照射距離為40 cm.取無菌的帶有磁力攪拌器的無菌培養(yǎng)皿，加入細(xì)胞密度為107～108個mL-1的菌懸液;將待處理的培養(yǎng)皿置于誘變箱內(nèi)的磁力攪拌儀上，靜止1 min后開啟磁力攪拌儀旋紐進(jìn)行攪拌，然后打開皿蓋，分別處理0，30，60，90 ，120，150 s，照射完畢后先蓋上皿蓋，再關(guān)閉紫外燈和攪拌器;分別取對照組和不同處理時間的菌液0.5 mL 進(jìn)行適當(dāng)稀釋(10-4，10-5，10-6)，將這3個稀釋度傾注在LB 固體培養(yǎng)基平板上(每個稀釋度做3個重復(fù))，37℃避光培養(yǎng)20 h，進(jìn)行平板活菌計數(shù)，用于計算紫外線誘變致死率［14］.

1.4 濃度梯度平板法篩選抗鱟素菌株

將不同時間誘變后的部分菌液，分別涂布于從低到高濃度的鱟素梯度LB 瓊脂糖培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)20 h后，分別挑取生長在高濃度鱟素平板上的大腸桿菌ATCC25922，JM109和對照平板上的單菌落，接種于MH 肉湯培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，然后進(jìn)行藥敏試驗，方法參考1.2.

1.5 抗藥性的判定折點

文獻(xiàn)關(guān)于細(xì)菌對AMPs 抗藥性的判斷折點不盡相同.MARTINEZ 等［15］通過測定誘導(dǎo)菌株與原始菌株的MIC，來判定其抗藥性，把細(xì)菌對AMPs的抗藥性定義為:誘導(dǎo)后菌株與對照組菌株的MIC值相比顯著性提高.本研究中，通過鱟素對原始菌株、相應(yīng)對照誘導(dǎo)菌株和誘導(dǎo)菌株的MIC 測定，如果誘導(dǎo)菌株與對照組菌株的MIC 值相比提高2倍以上，判斷為誘導(dǎo)出抗藥性，否則表明在此實驗條件下鱟素不能誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性.

1.6 對誘變菌株的進(jìn)一步篩選

將通過紫外線誘導(dǎo)獲得的抗鱟素耐藥菌株，在含有1/2MIC 濃度鱟素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代N次后，采集誘導(dǎo)不同代的誘導(dǎo)菌株，進(jìn)行MIC 測定.與此同時，在相同條件下，每代設(shè)不加鱟素的培養(yǎng)基連續(xù)傳代菌株，作為對照選擇菌株，把添加鱟素誘導(dǎo)的菌株作為陽性選擇菌株.參考上述1.5 方法，判定有無更高抗鱟素菌株的產(chǎn)生.

1.7 耐藥穩(wěn)定性測定

將獲得的抗鱟素耐藥菌株，在不含鱟素的MH肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代，每20 h 轉(zhuǎn)種1次，連續(xù)轉(zhuǎn)種5次后，將每次轉(zhuǎn)種形成的各子代菌株以15%甘油-70℃冰箱中保存，分別測定其MIC 值，以觀察其耐藥表型的穩(wěn)定性.

1.8 抗生素對鱟素抗藥菌株的敏感性測定

鹽酸左氧氟沙星和注射用芐星青霉素對抗鱟素菌株的敏感性測定，參考1.4.

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變大腸桿菌劑量的選擇

由圖1可知，隨著誘變劑量的遞增，大腸桿菌ATCC25922和JM109的致死率逐漸上升，表明誘變時間和大腸桿菌的存活率之間存在一定的正比關(guān)系.當(dāng)誘變時間≥60 s 時，死亡率已經(jīng)超過75%.在輻射強(qiáng)度和輻射距離一定的情況下，大腸桿菌ATCC25922和JM109的致死率與輻射時間成正比(圖1).

圖1 不同劑量紫外線照射大腸桿菌的致死率Fig.1 The death rate of Escherichia coli induced by different ultraviolet radiation dose

由靶子學(xué)說可知，紫外線在誘變作用之初，菌株數(shù)目很大，而此時的輻射劑量很少，輻射作用呈單擊現(xiàn)象，此時紫外光照射作用的效率很高.隨著照射時間的延長，存活的菌株逐漸減少，變異菌株逐漸增加，突變率增大.由圖1可知，在照射90 s后，菌株已大部分死亡，照射時間的增加已不能引起更多的變異.這時死亡的菌株被多次擊中的機(jī)會增加，以致大部分的能量被死亡的菌株吸收，突變率下降較快，效應(yīng)曲線趨于平穩(wěn).因此，可將混合菌紫外照射的最佳時間確定在菌株存活率從急劇下降到趨向平穩(wěn)的轉(zhuǎn)折點上，即照射時間為90 s.紫外照射時間為90，120，150 s的菌種致死率均大于90%，因此，經(jīng)初步篩選，挑選照射時間為60，90，120 s的菌株作進(jìn)一步篩選.

2.2 抗鱟素菌株的篩選

隨機(jī)挑取生長在高鱟素濃度梯度培養(yǎng)基平板上誘變時間為60 s 9株，90 s 7株和120 s 8株的大腸桿菌ATCC25922 菌株，以及不同誘變時間的各9株JM109 菌株，分別與相應(yīng)的對照組菌株進(jìn)行MIC的測定.從大腸桿菌ATCC25922和JM109 藥敏試驗的結(jié)果可知，鱟素對大腸桿菌ATCC25922和JM109的MIC分別為5，10 mg·L-1.大腸桿菌ATCC25922 經(jīng)紫外線誘變處理后，獲得了MIC為10 mg·L-1的抗鱟素大腸桿菌ATCC25922-A1-90和大腸桿菌ATCC25922-A2-902株，以及MIC為20 mg·L-1的抗鱟素大腸桿菌ATCC25922-A1-601株;大腸桿菌JM109 經(jīng)紫外線誘變處理后，它們中大部分呈負(fù)突變，MIC 值由10 mg·L-1降低為5 mg·L-1，一部分MIC 維持不變，如圖2和圖3.

從圖2可知，大腸桿菌ATCC25922 在紫外線誘變時間為60，90 s 時，有正突變菌株產(chǎn)生，60 s的正突變率為14.29%，90 s的正突變率為22.22%，在紫外線誘變不同時間下的負(fù)突變率均大于正突變率.從圖3可知，本試驗條件下，大腸桿菌JM109在紫外線誘變不同時間均未獲得抗鱟素的菌株.

對大腸桿菌ATCC25922 經(jīng)紫外線誘變產(chǎn)生的ATCC25922-A1-90，ATCC25922-A2-90，ATCC25922-A1-603株低抗鱟素菌株，分別經(jīng)過12 代1/2MIC 鱟素的連續(xù)傳代，它們的MIC 與傳代前均無變化，未誘導(dǎo)出更高抗藥性.

2.3 抗藥穩(wěn)定性測定

對誘導(dǎo)出的3株低抗鱟素菌株大腸桿菌ATCC25922-A1-90、ATCC25922-A2-90 以及AT CC25922-A1-60，在無藥MH 肉湯培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次后，此3株菌株的MIC 值均無變化，結(jié)果表明，這3株低抗鱟素菌株的抗藥性較穩(wěn)定.

2.4 抗生素對低抗鱟素菌株的敏感性測定

抗生素對低抗鱟素菌株的敏感性測定結(jié)果如表1.由表1可知，注射用芐星青霉素對大腸桿菌JM109的MIC 是大腸桿菌ATCC25922的8倍，對大腸桿菌ATCC25922 經(jīng)紫外誘導(dǎo)出來的3株低抗鱟素菌株的MIC 比原始菌株提高了128倍以上.大腸桿菌ATCC25922 無論是誘導(dǎo)菌株還是原始菌株，以及大腸桿菌JM109 均對鹽酸左氧氟沙星敏感.總之，低抗鱟素菌株對芐星青霉素有顯著抗藥性，對鹽酸左氧氟沙星仍然敏感.

3 討論

AMPs 通常能快速殺死細(xì)菌并具有廣譜抗菌活性，一些研究者認(rèn)為它不易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性.但是隨著對AMPs 研究的深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌也同樣會對某些AMPs 產(chǎn)生抗藥性［16～18］.研究表明，金黃色葡萄球菌能對防御素和人類AMPs 產(chǎn)生抗藥性，并且金黃色葡萄球菌對防御素、細(xì)菌素和陽離子AMPs的抗藥機(jī)制具有特異性［19］.因此，一種新的AMPs 產(chǎn)品細(xì)菌是否對其產(chǎn)生抗藥性成為問題的關(guān)鍵性.

表1 3種抗菌劑對大腸桿菌MIC 比較Table 1 MIC comparison of three agents for Escherichia coli

紫外線作為一種物理誘變因子，具有誘變效果明顯和方法簡單等優(yōu)點，是誘發(fā)微生物突變的一種非常有用的工具，在生產(chǎn)和科研中可利用它獲得性能優(yōu)良的突變株.目前，紫外誘變在生物防治方面應(yīng)用較多，如田連生等［20，21］2006年采用紫外線誘變處理與藥物培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)相結(jié)合的方法，分離篩選出對速克靈有顯著抗性的突變型木霉菌株UT-4，和對多菌靈具有明顯耐藥性的菌株T24-4和T24-6;詹儒林等［22］通過紫外線誘變獲得了對多菌靈的抗性菌株，試驗證明其抗性可提高120倍以上.Pexiganan 是一種陽離子AMPs magainin的類似物，GE［23］對大腸桿菌和銅綠假單胞菌通過化學(xué)誘變或者紫外誘變方法，均未誘導(dǎo)出對Pexiganan抗藥性的菌株.

而本研究中，通過紫外線誘變大腸桿菌ATCC25922 篩選抗鱟素菌株，獲得3株低抗鱟素菌株，對于JM109 未誘導(dǎo)出抗鱟素菌株.對誘導(dǎo)菌株和原始菌株進(jìn)行抗生素和鱟素的敏感性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)菌株對鱟素的抗藥性僅有輕微的提高，但對注射用芐星青霉素的抗藥性顯著性提高，對于此3株低抗鱟素菌株抗藥性機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究.因其AMPs的殺菌機(jī)制的獨特性，與抗生素相比，此結(jié)果進(jìn)一步暗示大腸桿菌通過誘變更易對抗生素產(chǎn)生抗藥性.

在抗生素耐藥性日益嚴(yán)重、病毒病和腫瘤仍未攻克的今天，AMPs的出現(xiàn)無疑為人們尋找理想的抗菌、抗病毒和抗腫瘤藥物提供了新的領(lǐng)域，AMPs的應(yīng)用將給解決細(xì)菌抗藥性、藥物殘留等關(guān)鍵問題帶來希望.

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