張建宏，張淑平，陳 文，康相濤，黃艷群

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

微衛(wèi)星標(biāo)記由于為多等位基因標(biāo)記，在基因定位、遺傳多樣性研究上具有重要的應(yīng)用價(jià)值，開發(fā)新的雞微衛(wèi)星標(biāo)記可進(jìn)一步豐富雞微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫.位于啟動(dòng)子區(qū)域的微衛(wèi)星具有潛在重要的功能［1，2］.雞Lpin1基因是雞重要的脂肪沉積相關(guān)的候選基因，雞Lpin1基因微衛(wèi)星的分布特性及其5′側(cè)翼區(qū)微衛(wèi)星變異的遺傳變異研究，可為進(jìn)一步開展雞Lpin1基因的表達(dá)調(diào)控研究打下基礎(chǔ).微衛(wèi)星DNA 又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat，STR)，是基因組中廣泛存在的一種以1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的核苷酸序列［3］.STR 標(biāo)記能揭示比RFLP 高得多的多態(tài)性，曾被作為第2代分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于遺傳變異分析、物種起源進(jìn)化、基因定位、指紋鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、法醫(yī)科學(xué)和動(dòng)植物遺傳育種等領(lǐng)域.因?yàn)镾TR 標(biāo)記必須依賴每類微衛(wèi)星兩端序列設(shè)計(jì)引物，這造成微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用與開發(fā)的數(shù)量受到了一定的限制［4］.微衛(wèi)星的功能目前尚不甚明了，曾一度被認(rèn)為呈選擇中性、缺乏功能性，但最近的報(bào)道顯示，微衛(wèi)星重復(fù)序列長度的變異能誘使啟動(dòng)子構(gòu)象的變異，影響其結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的能力［2］.對基因非翻譯區(qū)的微衛(wèi)星變異研究顯示其參與基因的表達(dá)與調(diào)控［5］;重復(fù)序列的動(dòng)態(tài)突變可引起mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化［6］;還有研究顯示，微衛(wèi)星參與細(xì)胞分化過程，有自身特異性結(jié)合蛋白，還能直接編碼蛋白質(zhì)，是一種非?；钴S的堿基序列［5］.Lpin1基因是2001年發(fā)現(xiàn)的與機(jī)體脂肪沉積有密切相關(guān)性的基因，為Lpin 蛋白家族成員［7］，是一種Mg2+依賴性磷脂酸磷酸化酶基因，具有磷脂酸磷酸化酶的活性［8，9］，與動(dòng)物脂肪形成密切相關(guān)［10］.在小鼠、人類Lpin1基因上的研究表明，該基因存在多種可變剪接產(chǎn)物，Lpin1-α 與 Lpin1-β 剪 接 體 在 人(NM _145693)［11］和鼠(NM_172950)［12］具有不同但互補(bǔ)的功能［13］.Lpin1的表達(dá)調(diào)控受多種因素的影響，磷酸化可改變基因的亞細(xì)胞定位，進(jìn)而影響Lpin1的活性并最終導(dǎo)致其表達(dá)變化［14］.雞Lpin1基因的編碼序列(HM473175)包含19個(gè)外顯子，王伯君等［15］發(fā)現(xiàn)雞Lpin1基因編碼區(qū)的變異與皮下脂肪厚、腹脂重呈現(xiàn)顯著的關(guān)聯(lián).李素雅等［16］進(jìn)行了雞Lpin1基因3′ UTR的變異研究.目前尚未見對雞Lpin1基因微衛(wèi)星序列分布及變異的報(bào)道.本研究進(jìn)行了雞Lpin1基因組內(nèi)微衛(wèi)星分布特性、5′側(cè)翼區(qū)的微衛(wèi)星遺傳變異鑒定及其潛在效應(yīng)研究，該研究可豐富雞的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫，為進(jìn)一步進(jìn)行該微衛(wèi)星變異的功能鑒定奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為Lpin1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及功能研究提供一定的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 血樣及其DNA 提取

河南家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程中心的固始雞(GS)、絲羽烏骨雞(SK)、河南斗雞(HG)、盧氏綠殼蛋雞(LS)、白來航(WL)、白洛克(WP)，每品種10 只，共計(jì)60份具有特色雞種的血樣.取80μL全血于1.5 mL Eppendorf 管中，加入500μL TE 緩沖液，8μL 25% SDS和9μL 蛋白酶K (10 g·L-1)，混勻置55℃水浴過夜.采用常規(guī)的酚氯仿抽提方法提取基因組DNA.抽提產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20℃保存?zhèn)溆?

1.2 微衛(wèi)星搜索和PCR 引物設(shè)計(jì)

采用SSR hunter 在雞Lpin1基因組(NC_006090)序列搜索潛在的微衛(wèi)星.根據(jù)雞Lpin1基因組(NC_006090)序列，使用Oligo 軟件設(shè)計(jì)1 對引物(MS)擴(kuò)增位于雞 Lpin1 編碼序列(HM473175)的5′ 側(cè)翼區(qū)(Flanking region，F(xiàn)LR)預(yù)測的啟動(dòng)子區(qū)域微衛(wèi)星序列，引物序列為:F:5′-AGCGGTCTCTCTTTGGTGAT-3′，R:5′-AGTAGTTGCTGCCTGAGACA-3′.預(yù)期PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為180 bp 左右.引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

1.3 PCR 擴(kuò)增及基因分型

PCR 反應(yīng)體系:DNA 模板0.5μL，上游引物0.25μL，下游引物0.25μL，Taq 酶0.1μL，2×Reaction Mix 6.25μL，雙蒸水5.15μL，總反應(yīng)體積12.5μL.PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火35 s ，72℃延伸35 s，72℃延伸10 min，30個(gè)循環(huán)，4℃終止反應(yīng).

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物首先經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步檢測.然后取2μL 非變性PCR 產(chǎn)物在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳2 h(130 V 電壓)，采用改良的銀染技術(shù)顯色、分型，并用UVP 自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)掃描保存圖像.

1.4 克隆測序

分別選取包含不同等位基因型的個(gè)體進(jìn)行50μL 體系PCR 擴(kuò)增，采用PCR 回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化(Tiangen).PCR 產(chǎn)物連接到pGM-T 載體(Promega)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐和X-gal的LB 固體培養(yǎng)基表面，挑取白斑進(jìn)行搖菌，12～16 h后進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增做進(jìn)一步鑒定.經(jīng)PCR 鑒定為陽性克隆的菌液送上海生物工程有限公司測序.對于包含不同等位基因的雜合型個(gè)體通過從同一個(gè)體選擇多個(gè)克隆進(jìn)行測序，以保證獲得2 條鏈的序列信息.

1.5 基因分析預(yù)測

采用FirstEF 軟件進(jìn)行Lpin1基因啟動(dòng)子和第1 外顯子預(yù)測，采用SSR hunter 軟件進(jìn)行微衛(wèi)星搜索，采用TFSEARCH 軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用BandScan 軟件進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠的基因型判別，采用Cervus2.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，具體指標(biāo)包括等位基因數(shù)、等位基因頻率、雜合度及多態(tài)信息含量(PIC)等參數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 雞Lpin1基因的啟動(dòng)子預(yù)測

將雞Lpin1基因的基因組序列(NC_006090)與其編碼序列(HM473175)進(jìn)行比對分析表明，雞Lpin1基因的第1 編碼外顯子位于基因組序列(NC_006090)的20629～20822 區(qū)域.采用FirstEF 軟件(http://rulai.cshl.org/cgi-bin/tools/FirstEF/)［17］從雞基因組序列(NC_006090)的正義鏈預(yù)測到雞Lpin1基因的啟動(dòng)子區(qū)域(12875～13444)，1個(gè)CpG window 位于13113～13314.CpGPlot 程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html)也預(yù)測到1個(gè)723 bp的CpG 島(12631～13353).

2.2 雞Lpin1基因微衛(wèi)星位點(diǎn)的搜索與分析

雞Lpin1基因組(NC_006090)序列約為50 kb，SSR hunter 軟件從中搜索到9個(gè)STR(表1)，其頻率為每5.5kb 有1個(gè)STR.這些序列多為二核苷酸型串聯(lián)重復(fù)序列，僅包含1個(gè)三核苷酸型和1個(gè)復(fù)合型(四核苷酸與二核苷酸復(fù)合型)STR，其重復(fù)次數(shù)在5～18 間.其中3個(gè)STR 位于雞Lpin1基因(HM473175)的5′ FLR，6個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)域.復(fù)合微衛(wèi)星(命名為CLP532)的核心序列正好位于預(yù)測的啟動(dòng)子區(qū)域附近，CLP532 微衛(wèi)星的核心序列在雞基因組(NC_006090)參考序列為(TATT)6/(TG)16(圖1).

圖1 位于預(yù)測的雞Lpin1基因啟動(dòng)子區(qū)域附近的復(fù)合微衛(wèi)星序列Fig.1 The composite microsatellite located at the predicted promoter region of chicken Lpin1 genomic sequence

表1 從雞Lpin1基因組序列(NC_006090)搜索到的STRsTable 1 STRs searched from the chicken Lpin1 genome sequence (NC_006090)

2.3 CLP532 復(fù)合微衛(wèi)星變異的鑒定

采用MS 引物從6個(gè)不同品種雞的基因組中擴(kuò)增CLP532 復(fù)合微衛(wèi)星核心序列，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，表明MS 引物對該微衛(wèi)星的PCR 擴(kuò)增特異性好、擴(kuò)增效率高，獲得了預(yù)期的180 bp 左右的條帶.從瓊脂糖凝膠電泳圖上可以清楚地看出，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在所檢測個(gè)體間存在多種長度差異，顯示該微衛(wèi)星在群體中存在豐富的變異.

由于受檢測靈敏度限制，對于一些長度差異在20個(gè)堿基內(nèi)的等位基因，采用瓊脂糖凝膠電泳常常無法有效分離，從而影響基因型判別的準(zhǔn)確性.因此本試驗(yàn)進(jìn)一步采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測CLP532 微衛(wèi)星的變異.采用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均得到了有效分離，在固始雞(GS)、絲羽烏骨雞(SK)、河南斗雞(HG)、盧氏綠殼蛋雞(LS)、白來航(WL)、白洛克(WP)6個(gè)品種中檢測共得到A，B，C，D，E，F(xiàn) 6種等位基因型(圖3).式為:(TATT )5/(TG )7，(TATT )5/(TG )8，(TATT)4/(TG)13，(TATT)4/(TG)15，(TATT)5/(TG)18和 (TATT)5/(TG)19.MS 引 物 擴(kuò) 增的CLP532 微衛(wèi)星序列長度在158～182 bp 間，其等位基因的序列長度變異在25 bp 左右.該復(fù)合微衛(wèi)星的核心序列TTAT和TG的重復(fù)數(shù)同時(shí)都發(fā)生了變異，且發(fā)現(xiàn)TG 核心序列的變異類型相對比TATT 多.

圖2 MS 引物部分?jǐn)U增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.2 The agarose gel electrophoresis photo of the part of PCR amplification products by MS primer set

選擇包含不同等位基因的代表性個(gè)體進(jìn)行克隆測序，成功獲得了A，B，C，D，E，F(xiàn) 6種等位基因的序列信息(圖4，表2).其核心序列的具體變異形

圖3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Fig.3 The map of MS primer amplification products by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis

圖4 CLP532 微衛(wèi)星不同等位基因的克隆測序峰Fig.4 The clone sequencing peak map of different alleles of CLP532 microsatellite

表2 CLP532 微衛(wèi)星等位基因核心序列及其PCR 擴(kuò)增長度Table 2 The core sequence of different alleles for CLP532 microsatellite and the PCR amplification length

2.4 CLP532 微衛(wèi)星在品種間的遺傳多態(tài)性

CLP532 微衛(wèi)星在品種間的變異統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(表3)，從6個(gè)雞品種中共檢測到6種等位基因.B，C，D 等位基因廣泛存在于所檢測的6個(gè)品種中，A 等位基因存在于4個(gè)品種中，E 等位基因存在于3個(gè)品種中，而F 等位基因僅存在于固始雞和盧氏綠殼蛋雞中，未檢測到品種特異性的等位基因.從固始雞、河南斗雞和盧氏綠殼蛋雞檢測到了5種等位基因，從白來航、白洛克和絲羽烏骨雞檢測到4種等位基因.6個(gè)品種雞的平均等位基因數(shù)為4.5，平均多態(tài)信息含量為0.665，平均雜合度為0.763，其中絲羽烏骨雞平均雜合度最高，而白洛克表現(xiàn)了最低的平均雜合度.

2.5 CLP532 微衛(wèi)星變異對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的影響預(yù)測

采用在線分析軟件TFSEARCH 進(jìn)行CLP532微衛(wèi)星G 等位基因核心序列(來自于基因組序列NC_006090)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(圖5)，在CLP532 微衛(wèi)星核心序列區(qū)域共預(yù)測到23個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括13個(gè)CdxA，3個(gè)HNF-3b，3個(gè)HNF-2，3個(gè)Pbx-1和1個(gè)XFD-1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn).分別進(jìn)行CLP532 微衛(wèi)星不同等位基因核心序列的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測表明，該微衛(wèi)星核心序列長度的變異引起了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的改變.E，F(xiàn) 等位基因與G 等位基因相比少了6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分別為3個(gè)CdxA，1個(gè)HNF-3b，1個(gè)HNF-2和1個(gè)Pbx-1.C，D 等位基因與G 等位基因相比則少了12個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分別為6個(gè)CdxA，2個(gè)HNF-3b，2個(gè)HNF-2和2個(gè)Pbx-1.

表3 CLP532 微衛(wèi)星在品種間的多態(tài)性Table 3 CLP532 microsatellite Polymorphisms among breeds

圖5 CLP532 微衛(wèi)星G 等位基因核心序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Fig.5 Transcription factor binding site prediction of CLP532 microsatellite core sequence for G allele

3 小結(jié)與討論

3.1 新的微衛(wèi)星序列的開發(fā)

微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物的基因組中，有報(bào)道顯示，除著絲粒及端粒外染色體的其它區(qū)域廣泛分布有微衛(wèi)星位點(diǎn)［18］.在哺乳動(dòng)物中似乎每個(gè)基因都至少存在1個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記［19］，PRIMMER等［20］報(bào)道在禽類基因組中微衛(wèi)星分布的密度相對較低，大約為20～39 kb 1個(gè)STR，并認(rèn)為這可能是家禽基因組中所含的非編碼DNA相對少于哺乳動(dòng)物所致.本研究顯示，雞Lpin1基因組上存在高頻率的微衛(wèi)星序列(平均每5.5 kb 則分布1個(gè)STR).目前主要應(yīng)用的6種微衛(wèi)星開發(fā)技術(shù)包括直接文庫篩選法、基于錨定PCR 技術(shù)法、單引物延伸富集法、選擇雜交富集法、生物信息學(xué)法、轉(zhuǎn)移擴(kuò)增法.但是利用生物信息學(xué)方法開發(fā)微衛(wèi)星只能應(yīng)用于序列信息已知的物種［21］.然而，隨著基因組序列、mRNA 序列等核酸序列的不斷增加，生物信息學(xué)法已會(huì)發(fā)展成為一種簡便、快速、實(shí)用的微衛(wèi)星開發(fā)技術(shù).本研究采用生物信息學(xué)方法從雞Lpin1基因組(NC_006090)序列發(fā)現(xiàn)了豐富的串聯(lián)重復(fù)序列，采用瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和克隆測序的方法從6個(gè)雞品種中鑒定了1個(gè)位于雞Lpin1基因5′側(cè)翼區(qū)(預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)域)的微衛(wèi)星序列多態(tài)性，豐富了雞微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫.

3.2 CLP532 微衛(wèi)星在雞品種間的遺傳多樣性

本研究采用新鑒定的CLP532 微衛(wèi)星標(biāo)記初步分析了該微衛(wèi)星在6個(gè)雞種的遺傳多樣性.從有限樣本數(shù)的6個(gè)雞品種中鑒定了6種等位基因，從固始雞、河南斗雞和盧氏綠殼蛋雞檢測到了5種等位基因，白來航、白洛克和絲羽烏骨雞檢測到4種等位基因.李素雅等［16］采用直接PCR 測序的方法從470 bp的3′-UTR 檢測到8個(gè)變異，采用與本試驗(yàn)相同的樣本，從固始雞和盧氏綠殼蛋雞檢測到7個(gè)變異位點(diǎn)，而從10 只河南斗雞中未檢測到任何變異，顯示了河南斗雞在該區(qū)域的高度保守性.河南斗 雞 在 雞Lpin1基 因3′-UTR和5′ 側(cè) 翼 區(qū)CLP532 微衛(wèi)星標(biāo)記變異的高度差異，顯示了河南斗雞在雞Lpin1基因不同區(qū)域選擇強(qiáng)度上的差異，這些差異是否與基因的表達(dá)調(diào)控乃至河南斗雞表現(xiàn)型有關(guān)聯(lián)尚需要進(jìn)一步研究.

3.3 Lpin1基因5′ 側(cè)翼區(qū)微衛(wèi)星潛在功能分析

微衛(wèi)星快速進(jìn)化而且存在于真核生物基因組的各個(gè)地方，但優(yōu)勢存在于非編碼DNA 區(qū)域［22］.本研究從雞Lpin1基因的基因組中搜索到9個(gè)微衛(wèi)星序列，3個(gè)位于基因的5′ 側(cè)翼區(qū)，6個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)域，微衛(wèi)星在真核生物的豐度和位置及其高的突變率提示其在基因調(diào)控上的潛在和廣泛的作用.啟動(dòng)子存在于結(jié)構(gòu)基因上游，是與基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)有關(guān)的一段特殊DNA 序列，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度.啟動(dòng)子區(qū)域的變異常會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合從而影響基因的表達(dá)調(diào)控.很多的報(bào)道證實(shí)了位于啟動(dòng)子區(qū)域的長度變異的STR 被克隆入載體能表現(xiàn)不同的表達(dá)能力［1，2，23］，SHIMAJIRI 等［1］研究表明matrix metalloproteinase 9基因的表達(dá)被短的STR 序列下調(diào)，TAE等［23］報(bào)道1個(gè)雙核苷酸重復(fù)序列在acetyl-CoA carboxylase基因的負(fù)調(diào)控效應(yīng)是CAAT box 依賴性的，可被CAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白而逆轉(zhuǎn).非編碼區(qū)的微衛(wèi)星序列對于基因表達(dá)調(diào)控具有一定的作用，主要是由于形成了特異DNA，如Z-DNA［24］，HDNA［25］.Z-DNA 在特定的染色體區(qū)域上執(zhí)行著重要的功能，如結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子和重組熱點(diǎn)均富含Z-DNA 結(jié)構(gòu)［26］.本研究預(yù)測雞Lpin1基因5′側(cè)翼區(qū)的STR 不同等位基因型可引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的變化，顯示該基因可能會(huì)通過該微衛(wèi)星序列長度變異程度進(jìn)行基因的表達(dá)調(diào)控.

雞Lpin1基因組內(nèi)存在豐富的串聯(lián)重復(fù)序列，從位于雞Lpin1基因5′側(cè)翼區(qū)(預(yù)測的啟動(dòng)子區(qū)域)的復(fù)合微衛(wèi)星CLP532中鑒定了7個(gè)等位基因，其長度差異在25 bp，顯示該微衛(wèi)星可作為新的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性等研究.軟件預(yù)測該微衛(wèi)星長度的變異可引起CdxA，HNF-3b，HNF-2和Pbx-1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目的改變，顯示了該微衛(wèi)星長度的變異對Lpin1基因表達(dá)調(diào)控的潛在效應(yīng).

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