陳雅婷譚宇蕙* 吳映雅丘鵬翔杜標(biāo)炎趙 青

（1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室，廣東 廣州 510006；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理學(xué)教研室，廣東 廣州 510006）

靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細(xì)胞周期和凋亡的影響

陳雅婷1譚宇蕙1* 吳映雅1丘鵬翔1杜標(biāo)炎2趙 青1

（1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室，廣東 廣州 510006；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理學(xué)教研室，廣東 廣州 510006）

目的 探討靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細(xì)胞增值和凋亡的影響。方法 分別用0、10、20、40μmol/L靛玉紅甲肟作用于HepG2細(xì)胞24、48、72h，采用MTT法檢測細(xì)胞抑制率；用0、10、20、40μmol/L靛玉紅甲肟作用于HepG2細(xì)胞24h后收集樣品，采用流式細(xì)胞術(shù)法檢測細(xì)胞周期及其凋亡率。結(jié)果 MTT法測定靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且表現(xiàn)出劑量和時(shí)間的依賴性，隨著濃度升高時(shí)間加長，抑制明顯（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)測定也表明靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用，凋亡隨著靛玉紅甲肟濃度的增大不斷地增加。細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面也可觀察出細(xì)胞隨著靛玉紅甲肟劑量和時(shí)間的增大而逐漸出現(xiàn)越來越多的凋亡，細(xì)胞核染色質(zhì)深染，聚集于核膜下呈新月形，細(xì)胞膜突起呈小泡樣，小泡脫落形成含核小體片段的凋亡小體。結(jié)論 靛玉紅甲肟確實(shí)可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，但靛玉紅甲肟對肝癌細(xì)胞作用機(jī)制還不明確，需要作進(jìn)一步的深入研究。

靛玉紅甲肟；HepG2；增值和凋亡

根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第五位。HepG2細(xì)胞，來源于人的肝癌組織。該細(xì)胞乙肝表面抗原陰性，對G418有抗性，對人生長激素有刺激反應(yīng)。靛玉紅多年前就被中國醫(yī)科科學(xué)院文獻(xiàn)報(bào)道動物和臨床均具有治療慢性中幼粒細(xì)胞白血病的作用[1]。靛玉紅甲肟是靛玉紅衍生物之一，也被報(bào)道可抑制體外多種腫瘤細(xì)胞增殖[2]。本文主要觀察靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細(xì)胞增值和凋亡是否也存在一定的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品和材料

RPMI1640（Gibco公司），小牛血清（PAA公司），PBS（SOJUBIO公司），靛玉紅甲肟（Sigma公司），MTT（Sigma公司），DMSO（Sigma公司），HepG2細(xì)胞（廣州中醫(yī)藥大學(xué)生化病理教研室）

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（含青霉素、鏈霉素各100u/mL），在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥品配制

靛玉紅甲肟（IRO）分別配制成10，20，40μmol/L備用。

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞抑制率

用2.5g/L的胰酶消化收集HepG2細(xì)胞，計(jì)數(shù)并重懸于含積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL，按100μL/孔細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板。置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后棄去上清，分別加入含靛玉紅甲肟10，20，40μmol/L的藥液繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置對應(yīng)的空白對照孔以及正常對照孔，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72h后，吸走藥液，加入不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液100μL，再每孔加入10μL MTT溶液（5mg/mL）繼續(xù)放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。用注射器小心吸走上清，留下藍(lán)紫色結(jié)晶，加入DMSO 150μL/孔震蕩均勻，在自動酶標(biāo)儀上以490nm波長測定每孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）]×100%

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡

用2.5g/L的胰酶消化收集HepG2細(xì)胞，計(jì)數(shù)并重懸于含積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，按2×106個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后棄去上清，分別加入含靛玉紅甲肟10，20，40μmol/L的藥液繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置對應(yīng)的空白對照孔以及正常對照孔，每組設(shè)置1個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h候，吸走藥液，用2.5g/L的胰酶消化收集每孔細(xì)胞，吹打制備單細(xì)胞懸液，移入新的5mL離心管中，4℃，1000g，離心5min，取出棄去上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次，再離心棄去PBS，加入4℃、75%乙醇放4℃冰箱固定細(xì)胞過夜。上流式細(xì)胞儀PI單染檢測細(xì)胞周期及其凋亡。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

分別用DAPI和PI染色劑（含破壁滲透劑）對經(jīng)靛玉紅甲肟10，20，40μmol/L處理過24，48，72h的細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 靛玉紅甲肟對HepG2細(xì)胞增值抑制作用

MTT結(jié)果如表1和圖1所示，其中可以看出，隨著靛玉紅甲肟濃度的增大和作用時(shí)間的延長，HepG2細(xì)胞的抑制率也逐漸增加，呈劑量和時(shí)間依賴性。

表1 各組HepG2 MTT測定結(jié)果的細(xì)胞抑制率（n=4）

圖1 靛玉紅甲肟對HepG2細(xì)胞增值的影響

2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率

HepG2細(xì)胞經(jīng)0、10、20、40μmol/L濃度的靛玉紅甲肟作用24h后，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸下降，S期細(xì)胞無明顯變化，G2/M期細(xì)胞比例逐漸上升。凋亡率不斷上升，分別為2.71%，12.36%，19.43%，29.53%。見表2和圖2。

表2 各組HepG2 流式細(xì)胞術(shù)24h測定結(jié)果的細(xì)胞抑制率（n=2）

圖2

2.3 細(xì)胞形態(tài)變化

正常情況下，HepG2細(xì)胞貼壁生長細(xì)胞飽滿均勻，而在靛玉紅甲肟的作用下，貼壁細(xì)胞不斷減少，細(xì)胞核染色質(zhì)深染，聚集于核膜下呈新月形，細(xì)胞膜突起呈小泡樣，小泡脫落形成含核小體片段的凋亡小體。如圖3所示。

圖3 HepG2細(xì)胞經(jīng)靛玉紅甲肟各濃度作用48h后DAPI和PI染色形態(tài)圖

3 討 論

中國的中醫(yī)多年前就已經(jīng)使用當(dāng)歸蘆薈丸來治療慢性粒細(xì)胞白血病，而其中青黛中含有的靛玉紅成分被證明是起主要治療作用的成分。多年來，人們對靛玉紅進(jìn)了各方面的研究，但因其水溶性與脂溶性均不良好，且出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)較多，因此研究者對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)的改造，發(fā)現(xiàn)靛玉紅甲肟就是一種水溶性較好易于吸收且不良反應(yīng)較小的一種靛玉紅的衍生物[3]。靛玉紅甲肟經(jīng)本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)對肝癌HepG2細(xì)胞體外是存在著明顯的抑制作用，而且呈現(xiàn)出時(shí)間和濃度的依賴性。有報(bào)道指出靛玉紅甲肟是一種具有選擇性的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDK抑制劑）[4]。細(xì)胞周期運(yùn)行中有兩個(gè)檢查點(diǎn)，分別是G1/S期檢查點(diǎn)和G2/M期檢查點(diǎn)，細(xì)胞周期中細(xì)胞時(shí)間的發(fā)生和順序都被檢查點(diǎn)監(jiān)控，以保證細(xì)胞的正常復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞DNA受損時(shí)，細(xì)胞周期就不能正常運(yùn)行，被阻滯于檢查點(diǎn)，而當(dāng)損傷超過細(xì)胞的修復(fù)能力時(shí)，則會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。有研究證明靛玉紅甲肟具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，主要是將細(xì)胞阻滯在G2/M期[5]。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)觀察到了靛玉紅甲肟作用后HepG2細(xì)胞凋亡的影響：用藥組的凋亡率高于對照組，呈濃度依賴性，表明靛玉紅甲肟確實(shí)可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。其細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞比例逐漸下降，S期細(xì)胞無明顯變化，G2/M期細(xì)胞比例上升，對其G2/M期有一定阻滯作用。細(xì)胞凋亡首先是細(xì)胞收縮變圓，然后與鄰近的細(xì)胞脫離。細(xì)胞的鐵壁能力會逐漸減弱，胞漿會濃縮，質(zhì)地致密的染色體會聚集，而后斷裂成許多凋亡小體。本實(shí)驗(yàn)也可觀察到經(jīng)過靛玉紅處理的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)這種凋亡的過程。然而目前靛玉紅甲肟對肝癌細(xì)胞作用機(jī)制還不明確，需要作進(jìn)一步的深入研究。

[1] 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所,分院附屬醫(yī)院,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所.靛玉紅治療慢性粒細(xì)胞白血病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究[J].中華內(nèi)科雜志,1979,18(2):83-88.

[2] Frank G.E,Perabo,Frossler C,et al.Indirubin-3’-monoxime,a CDK inhibitor induces growth inhibition and apoptosisindependent up-regulation of surviving in transitional cell cancer[J].Anticancer Res,2006,26(3A):2129-2136.

[3] Moon MJ,Lee SK,Lee JW,et al.Synthesis and structure activity relationships of novel indirubin derivatives as potent antiproliferative agents with CDK2 inhibitory activities[J].BioorgMe dChem,2006,14(1):237-246.

[4] Hoessel R,Leclerct S,Tang WC,et al.Indirubin,the active constituent of a Chinese antileukaemia medicine,inhibits cyclindepengdent kinases[J].Nature Cell Biology,1999,(1):60-67.

[5] Marko D,Sch?tzle S,Friedel A,et al.Inhibition of cyclindependent kinase 1 (CDK1) by indirubin derivatives in human tumor cells[J].Br J Cancer,2001,84(2),283-289.

Effect of Indirubin-3’-monoxime on Proliferation and Apoptosis of HepG2 cells

CHEN Ya-ting1, TAN Yu-hui1*, WU Ying-ya1, QIU Peng-xiang1, DU Biao-yao2, ZHAO Qing1
(Department of Biochemistry, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006; 2 Department of Pathology, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

Objective To discuss the effect of indirubin-3’-monoxime on proliferation and apoptosis of HepG2 cells. Method HepG2 cells were treated with 0, 10, 20, 40μmol/L indirubin-3’-monoxime for 24、48、72hours, then the apoptosis rate was measured by methabenzthiazuron (MTT) assay, also, it was measured by flow cytometry. Use the coloring agent DAPI and PI to dye the HepG2 cells which had been treated, then observe the cell morphology under the fluorescence microscope. Results Indirubin-3’-monoxime inhibited growth of HepG2 cells in a dose-dependent and time-dependent. The apoptosis rate increased after the treatment by indurubin-3’-monoxime at 24 hours, this apoptosis are differences between different dose group. In cell morphology, we can observe that more and more cells apoptosis along with the increasing of a dose and time of indurubin-3’-monoxime.Chromatin of cell nucleus concentrating and anachromasis, gathering in nuclear membranes as crescent-shaped. Cell membranes raised as bubble. The bubble will fall off and formed apoptotic body which contain fragment of nucleosome. Conclusion Indirubin oxime can indeed induce apoptosis in HepG2 cells, but Indirubin oxime on hepatoma cell mechanism is not clear, the need for further in-depth study.

Indurubin-3’-monoxime; HepG2; Proliferation and apoptosis

R735.7

B

1671-8194（2013）22-0003-02

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號：30973811）

*通訊作者:E-mail: tyhui@gzhtcm.edu.cn