楊菊清 ，楊風(fēng)云 ，張?jiān)鰪?qiáng) ，周新華 ，竇來義 ，周光瑞 ，謝鵬貴，別爾克博爾·博洛提漢

（1.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2.新疆鞏乃斯種羊場；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)四師七十九團(tuán)畜牧中心；4.新疆美利奴細(xì)毛羊科技發(fā)展有限責(zé)任公司；5.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站）

我國成功制作的第一批澳洲美利奴種公羊顆粒凍精迄今為止已保存了30多年，為了檢驗(yàn)其保存效果，作者等根據(jù)不同時(shí)期細(xì)毛羊育種需要，曾陸續(xù)在不同細(xì)毛羊育種場共進(jìn)行過8次輸精試驗(yàn)，各次試驗(yàn)匯總平均受胎率37.69%，平均產(chǎn)羔率114.33%。在試驗(yàn)過程中，對這批顆粒凍精在不同試驗(yàn)?zāi)晗藿鈨龊蟛煌盍旱氖芴ヅc產(chǎn)羔情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)精液凍制背景

1972年1月，我國從澳大利亞進(jìn)口了29只純種澳洲美利奴（中毛型）種公羊，其中分配給新疆鞏乃斯種羊場6只。這些公羊使用方向：一是為新疆毛肉兼用細(xì)毛羊?qū)а?，以提高其羊毛產(chǎn)量和凈毛率，改善體型外貌、羊毛品質(zhì)；二是與新疆毛肉兼用細(xì)毛羊、新波及波爾華斯母羊級進(jìn)雜交以培育中國美利奴羊。為了進(jìn)一步充分利用澳洲美利奴種公羊的優(yōu)良基因，最大限度地挖掘其改良潛力和遺傳資源，由新疆鞏乃斯種羊場、新疆畜牧研究所（現(xiàn)為新疆維吾爾自治區(qū)畜科院畜牧所）和新疆畜禽改良總站（現(xiàn)為新疆畜牧總站）有關(guān)科技人員組成新疆凍精研制協(xié)作小組，在1975年12月—1976年1月期間，共同凍制了用于長期保存試驗(yàn)的第一批顆粒凍精。凍制凍精時(shí)，6只種公羊的平均年齡6.5歲，平均體重89.7 kg。由于配種任務(wù)十分繁重，故凍制凍精的時(shí)間選在了非配種季節(jié)［1-2］。

1.2 精液的凍制與保存

在精液采集與凍制期間，澳洲美利奴種公羊采取全舍飼方式飼養(yǎng)管理，由專人管護(hù)。每天投喂苜蓿干草3 kg，混合精飼料（含燕麥、麩皮、油渣、豌豆）1 kg，胡蘿卜1kg，雞蛋1枚，早、晚各驅(qū)趕運(yùn)動2 000 m，每天采精2次。采精室溫度為17.8℃，制凍室溫保持在22.2℃。采集的原精液量平均1.0 mL（0.9～1.1），活力0.9～1.0，精子密度30億/mL（20～34億）。精液按1∶1比例進(jìn)行稀釋。稀釋液的主要成分包括乳糖溶液、新鮮卵黃、甘油，加青、鏈霉素若干。經(jīng)稀釋后的精液，先在0～5℃下平衡4 h，在干冰下制成顆粒，劑量0.1 mL/顆，每劑凍精顆粒中的有效精子數(shù)不低于4 500萬個(gè)，凍制后浸于液氮中保存。凍精制成后，存放在新疆畜禽改良總站，用于長期保存。

1.3 試驗(yàn)羊群

本批凍精的系列輸精試驗(yàn)先后在新疆鞏乃斯種羊場、烏魯木齊南山種羊場、溫泉種畜場和新疆美利奴公司尼勒克基地等細(xì)毛羊種畜場或養(yǎng)殖場進(jìn)行［3-5］。所有參加顆粒凍精輸精試驗(yàn)的生產(chǎn)母羊均由各試驗(yàn)羊場提供。入選的母羊年齡2～7歲（個(gè)別優(yōu)秀者還放寬到8歲）、配種時(shí)體重45 kg以上，身體健康、無生殖道疾病、被毛細(xì)度64～66支（20.1～23.0 μm）。所有參加凍精輸精的母羊均系自然發(fā)情，每天凌晨采用試情公羊試出。

1.4 凍精解凍與輸精

1.4.1 凍精解凍 在進(jìn)行本系列試驗(yàn)期間，顆粒凍精采用了干解凍法和濕解凍法2種方法進(jìn)行解凍［4］。干解凍法（1978—1995年）：在消毒好的試管里放入2個(gè)凍精顆粒，在80℃溫水里快速解凍；濕解凍法（2008年）：先在小試管中加檸檬酸鈉液0.5～1.0 mL，旋轉(zhuǎn)一圈后倒出，將管壁上剩余的少許液體加熱至40℃，投入2個(gè)凍精顆粒后，在40℃溫水中水浴。2種解凍方法都要求待顆粒溶解到1/3時(shí)取出試管，手搓至完全解凍。解凍后立即進(jìn)行鏡檢，活力評分采用“0～1等級”的十級分制加以評定。

1.4.2 輸精 凍精輸精在系列試驗(yàn)的8次輸精過程中，分別采用了常規(guī)子宮頸口深部輸精法（5次）和腹腔鏡子宮角輸精法（3次），每種方法輸精量均0.2 mL，含有效精子數(shù)在0.6億個(gè)以上。常規(guī)方法（1975年、1977年、1980年、1986年）：采取子宮頸深部輸精，每次輸解凍凍精2顆（0.2 mL），上午和下午各輸精1次；參加2008年試驗(yàn)的羊只僅在上午輸精1次，下午不再輸精，僅少數(shù)發(fā)情持續(xù)時(shí)間長的母羊，如果第2天仍然被試情公羊試出，就用原配種公羊凍精再輸精1次。腹腔鏡子宮角輸精（1987年、1991年、1995年）法：將試驗(yàn)羊固定于保定架上，抬高后軀，術(shù)部經(jīng)消毒后用氣腹針充氣。使用套管針在母羊腹部靠近乳房約3 cm處扎孔，分別插入內(nèi)窺鏡和撥棒。開啟電源后，在撥棒的幫助下找到子宮角。然后在子宮角靠近輸卵管的1/3處扎入輸精器，將精液緩慢輸入，每側(cè)子宮角輸凍精1顆（0.1 mL），共輸精0.2 mL。輸精后緩慢抽出輸精器及內(nèi)窺鏡、套管、撥棒。最后消毒傷口，將試驗(yàn)羊只放下手術(shù)架，即完成整個(gè)凍精輸精過程。

1.4.3 記錄 輸精的同時(shí)做好相關(guān)記錄，登記項(xiàng)目包括：輸精時(shí)間、公母羊號、精液活力、輸精量、輸精次數(shù)、復(fù)發(fā)情與復(fù)配情況及輸精時(shí)的氣溫狀況描述。由于第一批澳洲美利奴種公羊的凍精來之不易，為了不浪費(fèi)寶貴的精液，解凍活力評分0.1的凍精也進(jìn)行了輸精并做了特別注明。

2 結(jié)果與分析

2.1 解凍活力

統(tǒng)計(jì)的凍精解凍后的活力情況詳見表1。在本系列試驗(yàn)中，累計(jì)使用澳洲美利奴種公羊顆粒凍精2 600粒，統(tǒng)計(jì)的有效解凍凍精共1 291劑計(jì)2 582粒，精液解凍后在恒溫環(huán)境下鏡檢。按常例綿羊精液經(jīng)過凍制后，其解凍后的活力通常不及原精液未凍制前的一半水平。本批凍精保存后，曾經(jīng)多次進(jìn)行活力抽檢，目測活力一直保持在0.3～0.4之間，遠(yuǎn)低于鮮精時(shí)0.9～1.0的活力評分水平。在統(tǒng)計(jì)鏡檢的1 291劑解凍凍精中，活力評分在0.4分以上者極少，如評分0.5者僅5劑占0.39%、評分0.4者也僅44劑占3.41%，而活力評分為0.2～0.3者1 080劑占到總劑數(shù)的83.65%；試驗(yàn)現(xiàn)場鏡檢與實(shí)驗(yàn)室抽測目測的結(jié)果之間有些差異，這可能是由于試驗(yàn)時(shí)間跨度長、參加人員多，對解凍活力的評估可能存在一定的主觀偏差所致。各次試驗(yàn)解凍后精液的活力在0.3以上者（含0.3者）平均占到解凍凍精總劑數(shù)的53.14%，其中該批凍精在保存32年時(shí)，解凍后精液的活力為0.3者占到60.56%，與保存0年時(shí)的數(shù)據(jù)相比僅有2.1%的降幅。通過統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析比較，不同保存年限對精液的解凍活力沒有影響（P ＞0.05），在此前的報(bào)道已有明確闡述［5］。

表1 澳美羊凍精不同保存年份解凍活力

2.2 受胎效果

本批澳洲美利奴種公羊顆粒凍精在8次系列輸精試驗(yàn)中，合計(jì)輸精963只生產(chǎn)母羊，其中363只母羊產(chǎn)羔，共生產(chǎn)羔羊415只，受胎率分別為20.78%、32.0%、50.0%、42.31%、46.58%、41.46%、32.29%和32.39%，平均受胎率37.69%、平均產(chǎn)羔率114.33%［4］。其中保存到第32年時(shí)的受胎率雖然為32.39%，但經(jīng)過生物統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與早期的常規(guī)輸精試驗(yàn)結(jié)果比較，差異均不顯著（P＞0.05）［5］，以此說明這批凍精雖經(jīng)過長達(dá)30多年的保存，未顯著影響到其受胎效果。但是試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，凍精解凍后的活力評分對受胎率及產(chǎn)羔率的影響都較大，詳見表2。

從試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可見，凍精解凍后的活力越好，輸精后母羊的受胎率和產(chǎn)羔率就越高。不同解凍活力的凍精輸精后受胎率之間差異極顯著（P＜0.01），其相對應(yīng)的產(chǎn)羔率也差異顯著（P＜0.05），隨著解凍活力的提高受胎率和產(chǎn)羔率都表現(xiàn)出迅速提高的趨勢，解凍活力評分每提高0.1分，平均受胎率提高9.32個(gè)百分點(diǎn)，平均產(chǎn)羔率提高8.33個(gè)百分點(diǎn)。在試驗(yàn)中觀察到有5劑凍精得到了0.5的最高活力評分，輸精后有3只羊成功受孕，并產(chǎn)羔4只，受胎率和產(chǎn)羔率分別為60.00%和133.33%。而解凍活力在0.3者637劑輸精480只生產(chǎn)母羊，生產(chǎn)羔羊246只，受胎率44.79%，產(chǎn)羔率114.41%，受胎率與產(chǎn)羔率均都顯著低于前者（P＜0.05）。按照凍精輸精規(guī)程的相關(guān)規(guī)定要求，低活力凍精（0.2及以下）不能用于輸精用，但是為了不浪費(fèi)精液，這些活力低下的精液也進(jìn)行了輸精，并取得了意想不到的收獲：162劑活力評分為0.1的凍精輸精101只母羊后，獲得了23只羔羊，受胎率達(dá)22.77%。這些羊只雖然受孕產(chǎn)羔，生產(chǎn)的羔羊絕大多數(shù)均為單羔（95.65%），僅有1例雙羔（4.35%）。低活力凍精輸精取得的受胎率（22.77%），筆者認(rèn)為有可能是在主觀評分時(shí)發(fā)生判斷誤差所致。

表2 不同解凍活力澳美羊凍精輸精及產(chǎn)羔情況

采取的輸精方法不同得到的受胎效果也不同（見表3）。比較分析證實(shí)，采用腹腔鏡綿羊?qū)m內(nèi)輸精的效果都要高于常規(guī)宮頸輸精方法，兩者之間差異極顯著（P＜0.01），5次常規(guī)輸精的平均受胎率31.49%，雙羔率只有4.05%，總體效果不如腹腔鏡綿羊?qū)m內(nèi)輸精，而且產(chǎn)羔率也較后者低17.35個(gè)百分點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在同樣活力水平下，腹腔鏡輸精的受胎率高于常規(guī)輸精，其中在0.1、0.2、0.3活力水平時(shí)，兩種方法的受胎率分別相差12.18個(gè)百分點(diǎn)、14.34個(gè)百分點(diǎn)和29.42個(gè)百分點(diǎn)，說明活力好的凍精采取腹腔鏡輸精效果會更好。但采取腹腔鏡輸精法的母羊平均產(chǎn)羔率為111.89%，低于采用常規(guī)輸精法4.29%，由此可以證明產(chǎn)羔率與母羊的發(fā)情排卵狀況之間的關(guān)系密切，與配種輸精方式之間沒有必然的聯(lián)系。

表3 不同解凍活力凍精輸精方式及產(chǎn)羔情況

3 討論

本批試驗(yàn)的顆粒凍精是我國最早制作的美利奴型種公羊凍精之一，當(dāng)時(shí)我國綿羊精液冷凍保存技術(shù)剛剛起步，稀釋液的篩選、平衡、冷凍、解凍的適宜溫度等整個(gè)工藝操作技術(shù)才開始探索。因此，本試驗(yàn)使用的顆粒精液制作時(shí)技術(shù)尚未完全成熟。隨著生物冷凍技術(shù)的不斷提高和改進(jìn)，顆粒型凍精由于精子復(fù)蘇率和受胎率較安瓶型與細(xì)管型凍精要低，且有易受污染、不便標(biāo)記等缺陷，已逐步被適合于機(jī)械化生產(chǎn)又能克服上述缺陷的細(xì)管型凍精所取代。盡管如此，本系列試驗(yàn)經(jīng)過不同的保存時(shí)間、不同試驗(yàn)地點(diǎn)和不同試驗(yàn)條件下的輸精效果觀察，確證了本批顆粒型凍精的凍制質(zhì)量。

通過對不同試驗(yàn)?zāi)晗藿鈨龊蟮牟煌盍菏芴デ闆r的統(tǒng)計(jì)分析，也說明長期冷凍保存的綿羊精液，只要保存得當(dāng)，其解凍活力與受胎效果是不會因?yàn)楸４婺晗薜倪f增而衰減，至少截止目前的保存年限里，沒有發(fā)現(xiàn)衰退趨勢。同時(shí)，綿羊精液在冷凍制作過程中，對精子本身產(chǎn)生的傷損作用，采用腹腔鏡輸精子宮角輸精法進(jìn)行輸精，可以縮短精子的游走距離，降低精子的運(yùn)動能耗，從而有效地提高受胎率和多胎率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，凍精解凍的活力越好，使用腹腔鏡輸精受孕的幾率越大，因而，在使用長期保存的綿羊凍精進(jìn)行配種時(shí)，采用腹腔鏡輸精子宮角輸精法效果要更好。

［1］胡連志，楊菊清，郭文惠.腹腔鏡綿羊?qū)m內(nèi)輸精初試［J］.中國畜牧雜志，1989，25（5）：22.

［2］胡連志，徐佩賢，段長存.冷凍保存十五年的綿羊精液受胎效果［J］.草食家畜，1993（3）：20.

［3］田可川，阿扎提，史梅英，等.保存20年的美利奴羊凍精腹腔鏡輸精試驗(yàn)［J］.中國畜牧雜志，1999（1）：33.

［4］楊菊清，張?jiān)鰪?qiáng)，周光瑞，等.綿羊凍精不同保存年限的受胎效果連續(xù)觀察［J］.草食家畜，2009（3）：40-43.

［5］周光瑞，楊菊清.長期保存的綿羊凍精輸精受胎效果觀察［C］//2010年新疆畜牧獸醫(yī)學(xué)會年會論文集.新疆畜牧獸醫(yī)學(xué)會內(nèi)部資料，2010：1-3.