吳帥帥 ，李東江 ，呂春榮 ，權(quán)國(guó)波 ，郭成裕 ，洪瓊花

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)）

云南半細(xì)毛羊是以云南省昭通市飼養(yǎng)的山谷藏羊（昭通綿羊）和細(xì)毛雜交羊?yàn)榛A(chǔ)，引入羅姆尼公羊、林肯公羊，經(jīng)過(guò)育成雜交、橫交固定、自群繁育而培育成，2000年7月經(jīng)國(guó)家正式命名為“云南半細(xì)毛羊”。云南半細(xì)毛羊的育成填補(bǔ)了我國(guó)無(wú)粗檔半細(xì)毛羊品種的空白。然而，近年來(lái)由于市場(chǎng)導(dǎo)向的變化，云南半細(xì)毛羊數(shù)量出現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)［1］，因此非常有必要開(kāi)展云南半細(xì)毛羊種質(zhì)資源保存的研究。相對(duì)于傳統(tǒng)的活體保存而言，體細(xì)胞保存具有明顯優(yōu)勢(shì)，如占用場(chǎng)地小、投資小、不受群體和個(gè)體生理利用年限制約可以長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源等。此外，建立云南半細(xì)毛羊體細(xì)胞系對(duì)于開(kāi)展其相關(guān)生物技術(shù)研究，如體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作具有非常重要的意義。

目前，尚未見(jiàn)到云南半細(xì)毛羊皮膚成纖維細(xì)胞系的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用組織塊培養(yǎng)法和冷凍保存技術(shù)首次建立了云南半細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞系，并對(duì)其培養(yǎng)條件和細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為云南半細(xì)毛羊種質(zhì)資源保存和相關(guān)生物技術(shù)的開(kāi)展提供必要的資源和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 云南半細(xì)毛羊來(lái)自種羊場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑、儀器

1）本研究中所用的化學(xué)試劑除特別說(shuō)明外，均為Sigma公司生產(chǎn)，培養(yǎng)用DMEM、胎牛血清（FBS）由Gibco公司生產(chǎn)。一次性塑料培養(yǎng)皿為Nunclon公司生產(chǎn)。

2）主要儀器設(shè)備：倒置顯微鏡（Olympus，Nikon）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；實(shí)體顯微鏡（Olympus）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等。

1.2 方法

1.2.1 耳源組織塊的收集 云南半細(xì)毛羊耳尖消毒去毛后剪取0.5 cm2大小的皮塊，置于4℃保存液中，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。保存液為DMEM＋10%FBS＋200 u/mL青霉素＋200 u/mL鏈霉素。

1.2.2 原代細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌組織塊用生理鹽水液反復(fù)洗滌3次，然后用眼科剪剪成碎塊，置于直徑為50 mm培養(yǎng)皿中，每皿10塊進(jìn)行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為DMEM添加10%FBS，在5%CO2、飽和濕度和37.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)出后開(kāi)始換液，之后每3天換液1次。

1.2.3 細(xì)胞傳代及成纖維細(xì)胞的純化 待培養(yǎng)皿基本鋪滿單層細(xì)胞，去除培養(yǎng)液添加胰蛋白酶-EDTA（0.15%胰蛋白酶，0.02%乙二胺四乙酸）（TE）消化液控時(shí)控溫消化。倒置顯微鏡觀察，在成纖維細(xì)胞離壁前立即添加含有血清的培養(yǎng)液終止消化，制成細(xì)胞懸液，再移至離心管中，經(jīng)1 600 r/min離心5 min后棄上清，按照傳代前與傳代后1∶2的細(xì)胞數(shù)目比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行換液。等細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行下一次傳代。原皿中貼壁較緊的細(xì)胞，可換液繼續(xù)培養(yǎng)［2］。

1.2.4 細(xì)胞凍存與解凍 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)TE消化制成細(xì)胞懸液，1 600 r/min，離心5 min濃縮后，用凍存液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106～1×107個(gè)/mL，充分混勻，分裝凍存管，放入凍存盒中于-70°C過(guò)夜，而后投入液氮中保存［3］。細(xì)胞凍存液為DMEM+10%FBS+10%DMSO。解凍在42℃水浴鍋中進(jìn)行，用DMEM+10%FBS液逐漸稀釋凍存液，離心洗滌細(xì)胞3次，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度至1×105個(gè)/mL左右接種于24孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機(jī)選取3個(gè)孔，以解凍后24 h細(xì)胞貼壁率為指標(biāo)，計(jì)算細(xì)胞貼壁率，評(píng)價(jià)凍存效果。

1.2.5 細(xì)胞生物學(xué)分析實(shí)驗(yàn) 以云南半細(xì)毛羊第7代細(xì)胞作為對(duì)照，分別對(duì)第7、12、17代細(xì)胞進(jìn)行以下分析。

1.2.5.1 細(xì)胞活率測(cè)定 采用PI染法，對(duì)凍存前后的第7、12、17代細(xì)胞染色，統(tǒng)計(jì)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5.2 生長(zhǎng)曲線繪制 將第7、12、17代的細(xì)胞濃度調(diào)整到3×104個(gè)/mL，接種于24孔板內(nèi)。從接種時(shí)間起，每隔24 h計(jì)數(shù)3孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)，取3個(gè)孔細(xì)胞數(shù)目的平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 染色體制備 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中加入終濃度為0.25 μg/mL秋水仙素培養(yǎng)2.5 h。胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，經(jīng)1 600 r/min離心5 min，棄上清。加入0.075 mol/L的氯化鉀于室溫下放置40 min，離心棄上清。第一次固定時(shí)，加入5 mL甲醇與冰乙酸的混合液體（積比為3∶1）（現(xiàn)用現(xiàn)配）固定30 min。離心棄上清。再經(jīng)第二、三次固定，方法同第一次。棄上清，留0.5～1.0 mL制成細(xì)胞懸液，用100 μL移液器吸取細(xì)胞懸液，滴在冰冷潔凈的載玻片上。于75℃烤箱中干燥3 h，Giemsa染色20 min。

1.2.7 核型分析 挑選形態(tài)清晰、分散度良好、收縮適中的染色體中期分裂相，在油鏡下拍照，并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。利用ADOBEPHOTOSHOP 7.0軟件進(jìn)行染色體剪貼，對(duì)同源染色體進(jìn)行配對(duì)、測(cè)量、排隊(duì)，并按Levan等的標(biāo)準(zhǔn)確定著絲粒類型［3］。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 細(xì)胞活率計(jì)數(shù)中的數(shù)據(jù)，經(jīng)3次測(cè)量取平均值獲得。生長(zhǎng)曲線中各組數(shù)據(jù)，均通過(guò)6次計(jì)數(shù)取平均值獲得。染色體相對(duì)長(zhǎng)度經(jīng)過(guò)3次測(cè)量，取平均值所得，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

組織塊在添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d后，成纖維細(xì)胞開(kāi)始沿組織塊向周圍溢出，隨后有致密的上皮細(xì)胞貼壁延展生長(zhǎng)。成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間有明顯界限，前者為梭形，遷移能力強(qiáng)，細(xì)胞間隙大，后者為不規(guī)則的圓形或橢圓形，細(xì)胞之間沒(méi)有空隙。詳見(jiàn)圖1。

圖1 云南半細(xì)毛羊耳緣組織細(xì)胞培養(yǎng)

2.2 凍存對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性的影響

以DMEM+10%FBS+10%DMSO作為冷凍保護(hù)液對(duì)云南半細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存（圖2-A、B，表1）。結(jié)果顯示：第7、12、17代細(xì)胞在凍存前細(xì)胞活率并無(wú)明顯差別，解凍后細(xì)胞活率分別為89.3%、88.9%和87.9%，去除細(xì)胞凍存液培養(yǎng)24 h后貼壁率分別為88.9%、88.4%和87.1%。細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)4～5代，細(xì)胞形態(tài)保持初始狀態(tài)（圖2-C）。

表1 成纖維細(xì)胞凍存后培養(yǎng)%

圖2 云南半細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞解凍后培養(yǎng)

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

對(duì)云南半細(xì)毛羊第7、12、17代細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)7 d計(jì)數(shù)，然后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖3）。不同代次的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均為“S”型，細(xì)胞倍增時(shí)間分別為26、42、47 h。

2.4 細(xì)胞染色體數(shù)目分析

參照舒琥等［4］已發(fā)表計(jì)數(shù)方法，分別進(jìn)行第 7、12、17代細(xì)胞的核型分析（圖4-D、E、F）。每代取100個(gè)分裂相進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云南半細(xì)毛羊染色體中正常二倍體染色體（2n=54）所占比例分別為93%、86%和81%，伴隨著代次增加，染色體數(shù)目變異呈逐步增加的趨勢(shì)（表2）。

圖3 云南半細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖4 不同代數(shù)云南半細(xì)毛羊細(xì)胞中期染色體（1 000×）

表2 云南半細(xì)毛羊養(yǎng)細(xì)胞的染色體倍性分析

2.5 核型分析

測(cè)量結(jié)果表明，染色體組總相對(duì)長(zhǎng)度197.86，平均相對(duì)長(zhǎng)度3.66。參照Levan等［3］的命名法，以著絲點(diǎn)位置為判斷依據(jù)，對(duì)云南半細(xì)毛羊的染色體進(jìn)行了分類，常染色體中有3對(duì)為中著絲點(diǎn)染色體，23對(duì)為端著絲點(diǎn)染色體，X染色體為最大的近端著絲點(diǎn)染色體，Y染色體為最小的亞中著絲點(diǎn)染色體。

圖5 云南半細(xì)毛羊核型圖（1 000×）

3 討論

組織塊培養(yǎng)原代細(xì)胞所需的時(shí)間較長(zhǎng)，操作比較復(fù)雜，但生長(zhǎng)的細(xì)胞比較整齊，不會(huì)由于酶的長(zhǎng)時(shí)間作用而造成細(xì)胞的損傷或遺傳特性的改變。本實(shí)驗(yàn)表明，組織塊培養(yǎng)5 d后，周圍開(kāi)始溢出成纖維樣和上皮樣細(xì)胞，這與Guan等［5］的報(bào)道相一致。

在細(xì)胞保存過(guò)程中，需要盡可能降低細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而保持解凍后細(xì)胞活性、黏附能力及代謝活性［6］。本實(shí)驗(yàn)表明，以DMSO為凍存保護(hù)劑可以滿足冷凍保存云南半細(xì)毛羊皮膚成纖維細(xì)胞的要求。

云南半細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度，會(huì)隨著細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)的增加而延長(zhǎng)，細(xì)胞的適應(yīng)期也變長(zhǎng)。此外，在細(xì)胞的傳代培養(yǎng)過(guò)程中，隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞的二倍染色體數(shù)目異常的比例呈逐步上升趨勢(shì)，細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性有所改變。該現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于細(xì)胞本身端粒酶長(zhǎng)度的縮短［7］或者體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞的DNA造成的損傷［8-9］。

在進(jìn)行核型制備時(shí)，不同濃度秋水仙胺、低滲液、處理時(shí)間以及滴片時(shí)溫差等均可對(duì)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度和臂比值等產(chǎn)生影響［10］。此外固定和滴片也是核型分散成功的保證［11］，適當(dāng)?shù)牡纹叨纫彩侨旧w分散良好的重要條件［12］。實(shí)驗(yàn)最終確定了制備云南半細(xì)毛羊細(xì)胞核型的最優(yōu)條件，即用0.25 μg/mL終濃度的秋水仙胺處理培養(yǎng)細(xì)胞2.5 h，低滲40 min，1.5 m滴片，可得到數(shù)量多、分散度好的細(xì)胞中期染色體。在云南半細(xì)毛羊染色體長(zhǎng)度的測(cè)定計(jì)算中，實(shí)驗(yàn)對(duì)多個(gè)中期染色體分裂相進(jìn)行了觀察、分析、比對(duì)，以克服實(shí)驗(yàn)條件和方法不同對(duì)染色體產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，云南半細(xì)毛羊綿羊的染色體2n=54，與其他綿羊的染色體相似［13-14］。

本研究初步建立了云南半細(xì)毛羊皮膚成纖維細(xì)胞系，并對(duì)其體外培養(yǎng)、生物學(xué)特性以及染色體核型分型進(jìn)行了探討。該細(xì)胞系的建立對(duì)云南半細(xì)毛羊種質(zhì)資源的保存及相關(guān)繁殖生物技術(shù)研究如體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作具有重要意義，同時(shí)對(duì)于開(kāi)展其他動(dòng)物成纖維細(xì)胞系的建立也有一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)意義。

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