李 鵬

（沈陽(yáng)市蘇家屯區(qū)中興街道中興社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110102）

赤子愛(ài)勝蚓中溶栓成分的提取分離與純化

李 鵬

（沈陽(yáng)市蘇家屯區(qū)中興街道中興社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110102）

本文通過(guò)對(duì)赤子愛(ài)勝蚓（Eisenia foelide）的溶栓成分的跟蹤，確定出赤子愛(ài)勝蚓中活性成分的提取、分離、純化的方法。首先5 倍量生理鹽水提取 3 次，每次 2h。純化方法是組織勻漿用硫酸銨分段鹽析后沉淀用 20mM（pH8.0）Tris-Hcl緩沖液透析后經(jīng) DEAE SepHadex A-25 柱過(guò)濾，得到活性組分，再經(jīng)柱過(guò)濾，用凝膠電泳測(cè)其分子量為 25KD 和 30KD。

赤子愛(ài)勝蚓；溶栓成分；提??；分離；純化

近年來(lái)，對(duì)地龍?bào)w內(nèi)溶栓成分的研究非常踴躍?，F(xiàn)知的地龍溶栓成分有：地龍纖維蛋白溶纖酶、蚓激酶和蚓膠原酶三種酶系[1,2]，其中蚓激酶的溶栓成分為多種水溶性蛋白質(zhì)。性質(zhì)穩(wěn)定可在常溫下操作[3]。本文對(duì)赤子愛(ài)勝蚓中有效成分的提取條件進(jìn)行了探索并用層析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了純化。由于親和層析操作簡(jiǎn)單，分離快，因此為純化其溶栓成分有效的方法之一。

1 儀器與設(shè)備

1.1 儀器

JY99-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；FD-3-55D-MP臺(tái)式冷凍干燥機(jī)；透析袋；AKTA（瑞士，帶有紫外檢測(cè)儀）；BIO-RADPAC300電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.2 試劑

尿激酶（UK）標(biāo)準(zhǔn)品，800單位/支，批號(hào)：200415，中國(guó)藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原，批號(hào)：140607-200434，中國(guó)藥品檢定所；DEAE SepHadex A-25為pHarmacia產(chǎn)品；雙丙烯酰胺（Bis）Fluka chemic AG CH-9470.Buchs；三羥甲基氨基甲烷（Tris），批號(hào)：2002.1025，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)；甘氨酸批號(hào)：2001211，上海康達(dá)；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 赤子愛(ài)勝蚓提取溶劑的確定

2.1.1 赤子愛(ài)勝蚓溶栓活性成分提取

將赤子愛(ài)勝蚓用清水浸泡后，取三等份量的赤子愛(ài)勝蚓，分別用8倍量的0.02mol/L PBS溶液、8倍量的生理鹽水和8倍量20%乙醇溶液于組織搗碎機(jī)勻漿10min，再用超聲波粉碎10min，于4℃下離心至澄清，澄清液加入3倍量的丙酮，邊攪拌，靜置12h，過(guò)濾得沉淀用丙酮脫水，室溫?fù)]干，即得干粉。

2.1.2 尿激酶瓊脂糖——纖維蛋白平板法測(cè)定活性

2.1.2.1 試劑配制：①配制0.01mol/L pH7.75磷酸鹽緩沖液；②工作液：取磷酸鹽緩沖液與0.9%氯化鈉溶液1∶17稀釋③配制1%瓊脂糖液；④配制0.3%纖維蛋白原液；⑤配制1BP單位濃度的凝血酶液。

2.1.2.2 鋪板。

2.1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置。

2.1.2.4 樣品溶液的配制：分別取樣品1mg，各加入2mL 0.9%Nacl溶液溶解。

2.1.2.5 測(cè)定方法：分別吸取尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣本溶液10μL，加在平板上，37℃放置18h，取出，用卡尺測(cè)量溶圈的垂直兩直徑，在對(duì)數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品效價(jià)結(jié)果。

2.2 赤子愛(ài)勝蚓中溶栓成分提取工藝的確定

按《生物制品化學(xué)及其他檢定方法》中蛋白含量測(cè)定項(xiàng)下lowry法來(lái)測(cè)定每份蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 lowry法測(cè)定每份蛋白含量的結(jié)果

2.3 赤子愛(ài)勝蚓中溶栓成分的分離純化和分子量的測(cè)定

2.3.1 將蚯蚓洗凈，按上述方法加入五倍量的生理鹽水，初提掖。其中加入固體硫酸銨達(dá)30%飽和度，置冰箱中于4℃冷藏過(guò)夜。次日，以10000轉(zhuǎn)/分，4℃離心10min，上清液中加入固體硫酸銨達(dá)60%飽和度，置冰箱中于4℃冷藏過(guò)夜。棄上清液，沉淀用0.02mol/L pH8.0 Tris-Hcl緩沖液溶解，透析后吸附在DEAE SepHadex A-25離子交換凝膠柱上，用0.02mol/L PH8.0 Tris-Hcl（Nacl濃度從0.0～0.5mol/L）進(jìn)行洗脫，紫外檢測(cè)，收集活性液?；钚韵疵撘和肝龊笊螧enzamidine SepHarose 6B凝膠柱，并用緩沖液洗脫后，用含0.5mol/L精氨酸（argine）的20mM NaAc（PH5.0）洗脫，收集活性峰，活性洗脫液透析后冷凍干燥保存。

2.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定樣品分子量和純度

2.3.2.1 試劑配制：Ⅰ配制丙烯酰胺-雙丙烯酰胺儲(chǔ)備溶液；Ⅱ配制PH8.8三羥甲基氨基甲烷緩沖液；ⅢpH6.8三羥甲基氨基甲烷緩沖液；Ⅳ10%十二烷基硫酸鈉溶液；Ⅴ供試品緩沖液。

2.3.2.2 凝膠的配制：①制備分離膠；②制備濃縮膠；③制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液；④配供試品溶液。

2.3.2.3 測(cè)定方法：分別加入10μL的供試品標(biāo)準(zhǔn)蛋白，倒入電級(jí)緩沖液，200伏電壓下進(jìn)行電泳，當(dāng)藍(lán)色溴酚藍(lán)接近膠板底部時(shí)，停止電泳，取消膠板，在溴酚藍(lán)處做標(biāo)記。將膠板置于固定液中30min，取出置于37℃染色液中2、3h，然后置于脫色液中，至背景清晰。

3 結(jié)果與討論

3.1 赤子愛(ài)勝蚓中抗凝成分提取溶劑的確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 赤子愛(ài)勝蚓中抗凝成分提取溶劑的確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從上述結(jié)果看出，對(duì)于赤子愛(ài)勝蚓的初提溶劑，磷酸鹽、低濃度乙醇、生理鹽水對(duì)提取干粉的重量并無(wú)明顯差異。

3.2 尿激酶瓊脂糖——纖維蛋白平板法測(cè)定活性，結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 樣品測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

從以上兩表結(jié)合看，三種溶劑對(duì)提取的活性并無(wú)明顯差異，故擬定以生理鹽水提取。

表3 尿激酶瓊脂糖——纖維蛋白平板法測(cè)定活性結(jié)果

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

3.4 赤子愛(ài)勝蚓提取工藝確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 方差分析表，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 方差分析表

從結(jié)果可以看出，影響的主要因素是提取次數(shù)、加生理鹽水量和提取時(shí)間。最佳的提取條件為A3B2C3，即以5倍量的生理鹽水，提取3次，每次2h。

3.6 赤子愛(ài)勝蚓中抗凝成分中溶栓成分的分離純化和分子量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.6.1 溶栓成分得到分離純化。

3.6.2 分子量和純度：從SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜可以看出，前面所得到的活性組分為分子量25KD和30KD的兩個(gè)組分，且純度較高。

[1]徐鳳彩,高向陽(yáng),王煒軍,等.蚯蚓體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和藥物優(yōu)秀成分的研究進(jìn)展[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,22(3):86-89.

[2]任仁安.中藥鑒定學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986:408-409.

[3]程牛亮,王亞新,鄭國(guó)平,等.雙胸蚓纖溶酶II的純化及其性質(zhì)的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)臨床免疫學(xué)雜志,1996,8(2):8-10.

R284.2

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