何 濤李國慶* 謝 娟陳宏輝陳 汶

（1 南華大學附屬第二醫(yī)院消化科，湖南 衡陽 421001；2 南華大學醫(yī)學院診斷學教研室，湖南 衡陽 421001）

miR-145對HepG2細胞中腫瘤干細胞增殖的影響

何 濤1李國慶1* 謝 娟2陳宏輝1陳 汶1

（1 南華大學附屬第二醫(yī)院消化科，湖南 衡陽 421001；2 南華大學醫(yī)學院診斷學教研室，湖南 衡陽 421001）

目的 探討HepG2細胞中miR-145與肝癌干細胞之間的關系及可能的分子機制，為肝癌診治探索一條新方法。方法 分別以siRNA-NC-FAM和shRNA-GFP為轉染物，倒置熒光顯微鏡下觀察用脂質體Lipofectamine 2000轉染的效率，進行轉染效率評價。結果 中劑量的siRNA oligo轉染 HepG2細胞效果較好；各實驗對照組相比，miR-145-5p模擬物轉染組的miR-145表達明顯上調；過表達miR-145抑制HepG2細胞生長；轉染后48h模擬物轉染組過表達的miR-145可明顯降低OCT4蛋白水平及干細胞標志物CD90 mRNA的表達。結論 以Lipofectamin 2000為轉染試劑，使用中劑量的siRNA oligo轉染HepG2細胞效果優(yōu)于低、高劑量，同時明顯優(yōu)于轉染shRNA者；過表達miR-145可抑制HepG2細胞株增殖；miR-145可能通過下調OCT4基因表達抑制HepG2細胞株中腫瘤干細胞的增殖，是一種潛在的肝癌“保護性”miRNA。

miR-145；肝癌；Oct4基因；干細胞

MicroRNAs（miRNAs）是生物進化上高度保守的一類非編碼小RNA，研究表明其參與細胞活動的各方面，包括分化、生長、代謝、增殖、凋亡、腫瘤生成等[1]。miRNA主要參與基因的轉錄后調控，通過與靶基因的mRNA完全或者不完全的互補配對而起到促進目標mRNA降解或者抑制蛋白翻譯的作用[2]。研究顯示miRNA與肝癌的轉移、復發(fā)及預后關系密切[3-4]。胡瑧等[5]研究證實miR-145在肝癌HepG2細胞系中的表達水平低于正常肝組織。張帥等[6]研究發(fā)現miR-145通過下調Oct4的表達從而抑制肺腺癌A549細胞株中干細胞的增殖。我們擬通過導入miRNA145模擬物，增加細胞內miRNA145表達，進一步研究其對腫瘤干細胞增殖的影響。Oct4是參與調控胚胎干細胞自我更新，并且維持其全能性，最為重要的轉錄因子之一，主要表達于胚胎干細胞、生殖干細胞以及未分化胚胎癌組織中，它的劑量依賴性表達與決定細胞的分化程度息息相關[7]。Kosik等[8]發(fā)現在胚胎干細胞中miR-145可以靶向抑制Oct4蛋白表達,而對Oct4 mRNA表達沒有影響。而且發(fā)現miR-145在胚胎干細胞對細胞重編程基因Oct4、Sox2和Klf4的調控,這些證據提示我們miR-145可能在腫瘤干細胞中發(fā)揮重要作用。本課題以被國際公認的具有肝干細胞特性的HepG2細胞為實驗對象。通過lipofectamin2000介導hsa-miR-145 mimics轉染細胞HepG2，擬初步探討miR-145是否通過下調OCT4基因表達抑制HepG2細胞株中腫瘤干細胞的增殖，為臨床尋找治療肝癌的新靶點提供基礎。

1 資料與方法

1.1 體外細胞培養(yǎng)

使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞。傳代時使用2.5g/L的胰蛋白酶進行細胞的消化。用吹打管制備單細胞懸液，使用計數板計數，調整適當的濃度用于后續(xù)實驗。

1.2 Real Time PCR檢測

①實驗分組：1、hsa-miR-145 mimics組2、Blank組3、Mock組4、NC組。②引物設計：參考GenBank基因序列進行引物設計，并證實設計堿基序列與目的基因相符。③逆轉錄反應體系（表1）。

表1 逆轉錄反應體系表

1.3 統計學處理

本實驗結果使用SPSS13.0統計學軟件進行數據分析，實驗結果采用均數±標準差（）表示，單因素方差分析比較各組間差異，并用LSD檢驗法進行組間兩兩多重比較。顯著性檢驗水準取α＝0.05，確定P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 轉染效率評估

以HepG2細胞為研究對象，以Lipofectamin2000為轉染試劑，倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率。轉染siRNA，細胞狀態(tài)均尚可，在中高劑量時，轉染效率較低劑量好，在80%左右；轉染shRNA，細胞狀態(tài)相對稍差一點，轉染效率最高不到40%。故用中劑量的siRNA oligo轉染HEPG2細胞效果較好。

2.2 實時熒光定量PCR 檢測轉染效果

使用實時熒光定量PCR的方法檢測miR-145-5P在各組中的表達水平。電泳結果顯示PCR產物大小正確，無雜帶說明無非特異性擴增；轉染后24h及48h轉染模擬物組中的miR-145-5p mRNA表達水平均較各對照組顯著升高，有統計學意義（P＜0.05），而各對照組之間兩兩比較均無統計學意義（P＞0.05）。說明HepG2細胞轉染miR-145-5p mimics后miR-145-5p的表達水平顯著升高。

2.3 miR-145-5p mimics對OCT4的表達的影響

采用Western Blot法檢測轉染miR-145-5p mimics 48h后HepG2細胞中OCT4蛋白的表達水平，結果顯示：轉染miR-145-5p mimics組與NC組、Blank組、Mock組比較，OCT4蛋白表達均明顯下降，差異具有統計學差異（P＜0.05）。各對照組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明miR-145在翻譯水平上可以抑制Oct4的表達。

2.4 CCK-8分析肝癌細胞株生長活性的變化

采用CCK-8實驗分析miR-145-5p對HepG2細胞增殖能力的影響。結果顯示轉染miR-145-5p mimics組細胞的OD490值較各對照組均有所下降，且差異有統計學意義（P＜0.05）。而各對照組之間兩兩比較均無統計學意義（P＞0.05）。轉染miR-145-5p mimics組24h與48h、72h比較OD490值均有統計學意義（P＜0.05）。48h與72h比較OD490值無明顯差異 （P＞0.05）。說明過表達miR-145-5p能抑制HepG2細胞的增殖，但其抑制作用無明顯的時間依賴性。

2.5 miR-145-5p mimics對CD90 mRNA表達的影響。

采用熒光定量PCR的方法檢測CD90 在各組中的mRNA表達水平。結果顯示，轉染后48h轉染miR-145-5p mimics組中的CD90 mRNA表達水平較NC組、Blank組、Mock組明顯降低，有統計學意義（P＜0.05）。說明HepG2細胞轉染miR-145-5p mimics后CD90 mRNA的表達受到抑制。

3 討 論

通過CCK-8法對轉染miR-145-5p mimics的HepG2細胞進行功能學研究發(fā)現，過表達的miR-145可以抑制其生長，但無明顯時間依賴性。我們在miR-145抑制HepG2細胞生長的機制方面進行了探索，并針對腫瘤干細胞表面特異性標記物CD90進行了qRT-PCR，以此來評價腫瘤干細胞的增殖情況。研究結果表明HepG2細胞轉染miR-145-5p mimics后 CD90 mRNA的表達明顯受到抑制，而該作用很可能正是通過對OCT4基因的調控來實現的。綜上，miR-145可能通過抑制干細胞自我更新過程中的關鍵基因OCT4，進而抑制肝癌干細胞的增殖，抑制HepG2細胞生長。因此miR-145在肝癌中的低表達可以考慮用于腫瘤早期診斷，過表達抑制腫瘤細胞生長亦可使其成為腫瘤治療的靶標。

[1] Ambros V.The functions of animal microRNAs[J].Nature,2004, 431(7006):350-355.

[2] DP Bartel.MicroRNAs: genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[3] Braconi C,Patel T.MicroRNA expression profiling:a molecular tool for defining the phenotype of hepatocellular tumors[J].Hepatology,2008,47(6):1807-1809.

[4] Mott JL.MicroRNAs involved in tumor suppressor and oncogene pathways:implications for hepatobiliary neoplasia[J].Hepatology, 2009,50(2):630-637.

[5] 胡臻,李佳,房林.miR-145在肝癌中的表達和功能研究[J].同濟大學學報2012,33(2):43-46.

[6] 張帥,武雅琴,馮冬杰,等.miR-145通過下調OCT4基因抑制肺腺癌干細胞增殖[J].中國肺癌雜志,2011,14(4):317-322.

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R735.7

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1671-8194（2013）31-0062-02

*通訊作者：E-mail:ligq1970@163.com