高植明

（珠海市人民醫(yī)院藥學部，廣東 珠海 519000）

補骨脂丙酮提取物對骨質疏松癥的治療作用及其機制初探

高植明

（珠海市人民醫(yī)院藥學部，廣東 珠海 519000）

目的 考察補骨脂丙酮提取物的抗骨質疏松作用及其機制。方法 采用大鼠去卵巢骨質疏松模型，通過影像學、形態(tài)學、分子生物學方法考察補骨脂丙酮提取物的抗骨質疏松作用及其機制。結果 模型組的骨密度明顯下降（P＜0.05）；而H0高、中劑量組則顯著提升（P＜0.05）。HE染色顯示：模型組股骨骨小梁遭到嚴重破壞，而仙靈骨葆組、H0高、中劑量組骨小梁網狀結構的完整性好。熒光定量PCR顯示，模型組股骨β-ERmRNA水平與對照組沒有顯著差異。結論 補骨脂丙酮提取物H0組分高、中劑量組初步顯示抗骨質疏松特性，其機制與骨組織里β型雌激素受體無關。

補骨脂丙酮提取物；骨質疏松；分子機制

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是以骨量減少、骨微觀結構退化為特征的一種全身性骨骼疾病，臨床表現(xiàn)為骨的脆性增加，易發(fā)生骨折。在整個生命周期中，骨質在不停的形成和破壞，維持著一種動態(tài)平衡，當骨吸收與骨形成的偶聯(lián)中出現(xiàn)缺陷，骨吸收大于骨形成，導致骨質疏松發(fā)生。它好發(fā)于老年人和絕經后婦女?；颊咭蚤L骨斷裂性骨折和扁骨壓縮性骨折為常見，導致身高變矮，駝背，嚴重影響生活質量。尤其是絕經后婦女發(fā)病率更高。本實驗通過結扎并摘除12月齡雌性大鼠雙側卵巢，模擬人絕經后骨質疏松癥狀，借助影像學、組織形態(tài)學手段，考察補骨脂油脂部分防治大鼠骨質疏松的作用，通過熒光定量PCR等分子生物學手段，初步探索其作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑

仙靈骨葆膠囊（批號：100811，0.5g×40粒）），貴州同濟堂制藥有限公司。

1.2 實驗材料

成熟補骨脂種子500g，清平市場購買；丙酮，分析純；正丁醇，分析純；乙酸乙酯，分析純；硅膠300g，分析純。

1.3 動物

SPF級12月齡SD雌性大鼠90只（體質量375±25g），由廣東省實驗動物中心提供，動物合格證號：0037852，許可證號：SCXK（粵）2003-0002，粵監(jiān)證字2009A003。

1.4 儀器

LUNAR PRODIGY雙能X射線骨密度儀（通用公司）；ENCORE10.0分析軟件（通用公司）；光學顯微鏡（奧林巴斯公司）；7500全自動熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.5 研究方法

1.5.1 補骨脂油脂部分的提?。禾崛》椒ǎ撼墒煅a骨脂種子500g在粉碎機中粉碎好，倒進容積為3L的四口圓底燒瓶中，加入丙酮（2L）提取，在水浴鍋中保持丙酮微沸狀態(tài)回流7h后，減壓濃縮，將所得的提取物的一部分（10g）轉移至灌以500g硅膠的層析柱，用正丁醇和乙酸乙酯按不同比例組合的洗脫液洗脫（10∶0，10∶1，5∶1和0∶10），最終獲得用2L正丁醇（10∶0）洗脫出來的組分H0和用2L正丁醇-乙酸乙酯洗脫液（10∶1）洗脫出來組分H1，這兩種無色油類組分即為補骨脂丙酮提取物的非極性部分。其余比例洗脫液的洗脫成分為極性成分，舍去。

1.5.2 動物實驗：取12月齡SPF級的雌性SD大鼠90只，隨機分成9組，每組10只大鼠，再隨機抽出兩組分別作為對照組和假手術組，其余8組行結扎并摘除雙側卵巢手術，分別為模型組、陽性對照組（雌激素）、H0-h（高劑量）、H0-m（中劑量）、H0-l（低劑量）、H1-h（高劑量）、H1-m（中劑量）、H1-l（低劑量），假手術組除了不摘除卵巢外其余處理同模型組。手術一周后開始每天灌胃給藥，對照組、假手術組、模型組分別灌以等量的生理鹽水，其余各組灌以相應劑量的藥物[16]：H0-h（高劑量）90mg/（kg·d）；H0-m（中劑量）30mg/（kg·d）；H0-l（低劑量）10mg/（kg·d）；H1-h（高劑量）90mg/（kg·d）； H1-m（中劑量）30 mg/（kg·d）；H1-l（低劑量）10mg/（kg·d）。灌胃容量控制在約2mL/只，每周稱量體質量一次，根據(jù)體質量調整劑量。常規(guī)飼養(yǎng)，12周后殺動物取材，檢測相應指標。

表2 補骨脂丙酮提取物對骨質疏松大鼠股骨組織雌激素受體的影響（）

表2 補骨脂丙酮提取物對骨質疏松大鼠股骨組織雌激素受體的影響（）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；B=copy/μL cDNA；A=B（ER β）÷B（GAPDH）

組別例數(shù)劑量(mg/kg)B(ERβ)(104copy/μL cDNA)B(GAPDH)(103copy/μL cDNA)A(10-3)t值對照組8—1009.3±1003.211316.3±7343.188.7±104.31.677模型組8—150.2±114.17178.2±7618.365.7±94.6—仙靈骨葆組712086.1±62.32109.7±2220.3375.2±512.51.421 H0高劑量組890198.5±49.761617.3±43481.69.2±11.31.451 H0中劑量組930282.4±46.124924±29572.354.4±58.20.251 H0低劑量組101087.1±19.87758.3±5738.723.0±24.31.073 H1高劑量組89084.2±53.620629±29425.116.3±16.11.261 H1中劑量組1030195.1±161.04109.8±4931.21190.6±2061.31.335 H1低劑量組71092.1±31.214951.1±22234.399.1±114.20.544

1.6 骨密度的測量

宰殺動物前，稱取大鼠體質量，以3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，把大鼠四肢伸展俯臥于通用公司LUNAR PRODIGY雙能X射線骨密度儀上，測量全身BMD，用ENCORE10.0分析軟件分析。

1.7 股骨干骺端的矢狀面的HE染色觀察

每組隨機抽取4只大鼠的左股骨，取股骨下1/3段，浸泡于10%的中性甲醛中，4℃固定72h，固定液為樣本體積的5倍以上，5%硝酸脫鈣24h，然后按50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每級15min，二甲苯透明24h后，常規(guī)石蠟包埋，在冷凍切片機上沿股骨干骺端矢狀面按4μm連續(xù)切片，HE染色，40倍光學顯微鏡下觀察骨松質顯微結構的變化。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 補骨脂丙酮提取物對骨質疏松大鼠骨密度的影響，見表1。

表1 補骨脂丙酮提取物對骨質疏松大鼠骨密度的影響（）

表1 補骨脂丙酮提取物對骨質疏松大鼠骨密度的影響（）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別例數(shù)劑量(mg/kg)骨密度(10-2g/cm2)t值對照組8-17.4±0.6**5.599模型組8-16.7±0.3-仙靈骨葆組712016.7±0.80.684 H0高劑量組89017.7±0.9**3.424 H0中劑量組93017.6±0.8**3.535 H0低劑量組101017.3±0.62.032 H1高劑量組89016.9±0.22.081 H1中劑量組103017.2±0.91.645 H1低劑量組71017.0±0.71.557

從表1可見，假手術組與對照組相比骨密度和骨礦含量沒有顯著差異；模型組與對照組相比，骨密度含量下降具有顯著性差異（BMD：P＜0.01）。

2.2 補骨脂丙酮提取物對骨質疏松大鼠股骨干骺端骨松質的HE染色觀察（40×）的影響，見圖1。

2.3 補骨脂丙酮提取物對骨質疏松大鼠股骨組織雌激素受體的影響，見表2。

由表2可知，模型組的ERβmRNA水與假手術組沒有顯著差異，提示摘除雙側卵巢誘導的骨質疏松大鼠體內ERβmRNA水平沒有變化。

3 討 論

圖1 去卵巢大鼠股骨的在光學顯微鏡下觀察的病理變化（HE染色×40）

OVX大鼠模型的是骨質疏松實驗的金標準，具有重現(xiàn)性好，機制明確等特點，特別適用絕境后骨質疏松的藥物治療研究。實驗結果顯示，OVX模型的骨密度顯著低于對照組，表明造模成果。陽性對照藥仙靈骨葆膠囊，是治療骨質疏松的常用中成藥，療效在業(yè)界中得到廣泛的認可[1-6]，本實驗數(shù)據(jù)顯示，仙靈骨葆在12周預防治療中并沒明顯改善OVX大鼠的骨密度，而HE染色顯示，接受仙靈骨葆干預后，大鼠的股骨骨干骺端的骨小梁網狀結構明顯比模型組的要完整。初步分析原因有二，一是由于仙靈骨葆膠囊內容物為浸膏干粉，溶解性差，定量容易有系統(tǒng)偏差，二是有研究指出，仙靈骨葆治療老年性骨質疏，雖然能較好維持骨密度，但作用緩慢，連續(xù)治療12個月開始改變骨密度的下降趨勢，連續(xù)治療24個月后骨密度才明顯上升[7]。因此，雖然定性指標（HE染色）反應出差異，但還不足以體現(xiàn)在量的區(qū)別上，若今后改進為應用仙靈骨葆片劑，提升藥物溶解性和生物利用度，或加大給藥劑量，同時延長藥物干預時間，有望克服以上問題。補骨脂對骨質疏松的治療作用已被學術界認可[8-15]，它有雌激素樣作用，能防止骨吸收，增加骨密度，但補骨脂的成分復雜，其治療骨質疏松的有效成分一直不夠明確，作用機理不夠清晰，腎毒性和光毒性等不良反應也一直制約著補骨脂的發(fā)展前景[16-19]，故有必要對其藥效物質基礎進行研究，闡明其活性成分，對其進行有效的提取、純化、制成現(xiàn)代制劑和進行有效的質量控制，才能提煉出療效顯著，并毒性最低的成分。吉力[20]等對補骨脂中35種化學成分作過綜述，對補骨脂油脂性提取物的研究在國內外卻極為罕見。Miura H[21]發(fā)現(xiàn)，補骨脂的油脂部分能增加3周齡佝僂病大鼠的骨強度，提高血中無機磷酸鹽水平；Zaka的研究首次明確了補骨脂油脂部分的成分是三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油及游離脂肪酸[22]。但其增強骨組織強度的作用機制尚不明確。顯然，Miura H的研究結果明確了補骨脂油脂部分具備顯著的促進大鼠骨骼礦化的作用，而這種促礦化作用沒有性別和月齡的界限。因此我們有理由相信，這種物質同樣適用于成年大鼠的骨質疏松模型的治療上，本實驗結果顯示，補骨脂油脂部分的H0組分的高劑量組和中劑量組明顯提高了OVX大鼠的骨密度，HE染色也顯示，H0組分干預的OVX大鼠的股骨干骺端骨小梁網狀結構較完整，初步體現(xiàn)出H0組分的抗骨質疏松能力。激素受體分為兩種亞型：α型和β型；α型廣泛分布在卵巢、子宮等女性器官，是雌激素替代療法致癌的根源，β型雌激素受體大量分布在骨組織中，主導成骨細胞的活性，促進骨形成，提高骨密度。骨組織里的β型雌激素受體mRNA水平的變化，與骨質疏松的發(fā)病機制以及藥物干預機制息息相關，而熒光定量PCR是當今最先進的PCR定量技術之一，適合于任何組織的mRNA水平定量。本實驗顯示模型組股骨組織里的β型雌激素受體mRNA水平的變化與對照組沒顯著差異，證明本實驗的大鼠骨質疏松模型與此機制無關。

綜上所述，補骨脂丙酮提取物提取H0組分在大鼠實驗中初步體現(xiàn)出抗骨質疏松特性，但作用靶點以及機制仍未完全闡釋清楚，并存在實驗設計需要改進、研究樣本小等問題，以后應加強這方面的科研投入。

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Effects and Mechanism of Psoralen Acetone Extract on Osteoporosis

GAO Zhi-ming
(Department of Pharmacy, Zhuhai People's Hospital, Zhuhai 519000, China)

Objective To study preventive effects and mechanism of Psoralen acetone extract on osteoporosis. Methods Ovariectomized rats were used as the model of osteoporosis,and preventive effects and mechanism of Psoralen acetone extract on osteoporosis were investigated by the methods of radiology, morphology, molecular biology.Result The BMD of model group decreased significantly(P＜0.05) , while H0 groups with high dose and middle dose were significantly increased (P＜0.05). HE staining showed that: femoral trabecular bone of model group was severely damaged, but that of Xianlinggubao group, H0 groups with high dose and middle dose had kept a well shape of mesh. Fluorescent quantitation PCR showed that right femur of rats of β-type estrogen receptor mRNA levels were not significantly different comparing with the control group. Conclusion The Psoralen acetone extract H0 at high dose and middle dose showed effects against osteoporosis of rats. The mechanism of anti-osteoporosis of H0 component had nothing to do with the β-type estrogen receptor in osteoblasts.

Psoralen acetone extract; Osteoporosis; Molecular mechanisms

R282.710.7；R589.5

B

1671-8194（2013）31-0001-03

廣東省中醫(yī)藥局建設中醫(yī)藥強省基金項目(No.20112039)支持