王紹杰，郭雪娜，何秀萍，張博潤

1 中國科學院微生物研究所酵母菌分子遺傳與育種實驗室，北京 100101

2 中國科學院大學，北京 100049

麥角甾醇是真菌細胞各種膜結構的重要組成部分，它在確保膜結構的完整性、流動性、通透性、與膜結合酶的活性、細胞活力等方面具有重要的生理功能[1-3]。麥角甾醇還是一種具有重要經(jīng)濟價值的代謝產(chǎn)物，是合成維生素D2的前體和生產(chǎn)可的松、黃體酮、蕓苔素內(nèi)酯和抗癌藥物等甾醇類藥物的重要原料[4-5]。酵母菌發(fā)酵法是國內(nèi)外麥角甾醇生產(chǎn)的主要方式。在眾多的酵母菌中，以釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 麥角甾醇的含量最高，因而成為發(fā)酵法生產(chǎn)麥角甾醇的優(yōu)選菌種[6]。

酵母菌麥角甾醇產(chǎn)量同時受到細胞生長速率和細胞麥角甾醇合成能力的影響，但野生型酵母菌細胞生長和麥角甾醇合成之間常表現(xiàn)出一種相互制約的關系[7-9]。利用傳統(tǒng)的微生物育種技術，并結合代謝途徑的定向優(yōu)化，可以在一定程度上從菌種層面突破細胞生長和麥角甾醇合成之間的相互制約，提高麥角甾醇產(chǎn)量[9-11]。同時通過發(fā)酵條件的優(yōu)化也可以適當協(xié)調(diào)細胞生長和麥角甾醇合成之間的制約關系，實現(xiàn)麥角甾醇產(chǎn)量的提高。以葡萄糖和酵母粉等為主要原料的發(fā)酵條件優(yōu)化已有較多報道[8-10,12-13]。但通常情況下，發(fā)酵培養(yǎng)基約占發(fā)酵成本的50%，實現(xiàn)廉價、可再生原料的替代是新型發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展趨勢[14]。糖蜜作為制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，富含蔗糖、葡萄糖和果糖等碳源，以及維生素和無機鹽，是發(fā)酵工業(yè)中一種經(jīng)濟易得的原料[15-16]。在我們前期研究中，對甘蔗糖蜜為主要原料的酵母菌發(fā)酵法生產(chǎn)麥角甾醇發(fā)酵條件進行了初步分析[11]。

響應面分析法(Response surface methodology,RSM)作為解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，已應用于多種發(fā)酵過程和生物反應過程的優(yōu)化[16-18]。本研究將以甘蔗糖蜜為主要原料，通過響應面分析獲得優(yōu)化培養(yǎng)基；在此基礎上進行5 L 發(fā)酵罐的發(fā)酵實驗及發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化，以期為以糖蜜為主要原料的酵母菌發(fā)酵法生產(chǎn)麥角甾醇工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵菌種

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae YEH56(pHXA42)由本實驗室構建和保存[11]。

1.1.2 實驗試劑

甘蔗糖蜜(含糖量為48%，總氮4.6%，總磷0.6%，Mg2+0.02%，Cu2+0.03%， Zn2+0.008%，F(xiàn)e2+0.06%，W/W)購自北京市海昌鑫霖有限公司；玉米漿購自北京保樂吉生物科技有限公司；麥角甾醇標準品購自Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母菌常規(guī)培養(yǎng)、保存及發(fā)酵用種子培養(yǎng)基YEPD 參照文獻[11]。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜83.3 g，磷酸1.68 g，尿素2.0 g，溶于蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)pH 至5.4，定容至1000 mL。

優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜83.3 g，KH2PO41 g，K2HPO41.86 g，CuSO4.5H2O 17.5 mg，F(xiàn)eSO4.7H2O 13.9 mg，MgSO4.5H2O 12.3 mg，玉米漿10 mL，溶于蒸餾水中，調(diào)pH 至6.5，定容至1000 mL。

糖蜜流加補料發(fā)酵基礎培養(yǎng)基是將糖蜜濃度降低到41.6 g/L，KH2PO41 g，其他組分和pH 與優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基完全相同。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

從保存的菌種斜面上挑一環(huán)菌，轉接到50 mL YEPD 中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)18 h；按10%(V/V)接種量將種子液轉接到裝45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)36 h。

1.2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

從保存的菌種斜面上挑一環(huán)菌，轉接到5 mL YEPD 液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)16 h，然后轉接到200 mL YEPD 液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)18 h，按10%(V/V)接種量轉接至裝有2 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L 發(fā)酵罐(上海保興生物工程設備有限公司)中進行發(fā)酵，溫度為30℃，轉速400 r/min，通氣量4 L/min，pH 控制在6.50左右。

進行流加補料分批發(fā)酵時，發(fā)酵罐初始裝液量為1.8 L 基礎培養(yǎng)基。補料液為含糖量為300 g/L的糖蜜，在發(fā)酵開始后5 h 以10 mL/h 的速度流加，從10 h 開始流加速度增加到20 mL/h，直到發(fā)酵結束為止。發(fā)酵12 h 前發(fā)酵條件控制同上；發(fā)酵12～30 h，轉速550 r/min，通氣量6 L/min，發(fā)酵末期恢復到初期轉速和通氣量。

1.2.3 分析方法

細胞生物量的測定和麥角甾醇的提取參照文獻[9]進行。細胞麥角甾醇含量測定參照文獻[11]進行。麥角甾醇產(chǎn)量指每升發(fā)酵液收獲的細胞所含的麥角甾醇的量(mg/L)，轉化率為每消耗1克糖蜜產(chǎn)生麥角甾醇的毫克數(shù)(mg/g)，麥角甾醇產(chǎn)率指每小時每消耗1克糖蜜產(chǎn)生的麥角甾醇毫克數(shù)(mg/(g·h))。

2 結果與分析

2.1 影響麥角甾醇產(chǎn)量的顯著因素的篩選

依據(jù)單因子實驗結果及影響酵母菌生長代謝的一般因素，本研究選取糖蜜糖濃度(X1)、CuSO4(X2)、FeSO4(X3)、MgSO4(X4)、玉米漿(X5)、K2HPO4(X6)、KH2PO4(X7)、和pH (X8)為考察因素，并余留3個空白項以估計實驗誤差；每個因素設2個水平，以麥角甾醇產(chǎn)量(mg/L)為響應值，進行試驗次數(shù)為N=12的Plackett-Burman 設計，具體試驗設計及結果見表1，利用Design Expert 7.1.3軟件對表1中試驗數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)本試驗獲得的模型的“Prob (P)>F”為0.0024，說明本試驗模型顯著。該模型的決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為0.9948和0.9811，說明相關性良好。其中影響酵母菌麥角甾醇產(chǎn)量的顯著因素為CuSO4(P=0.0002)、K2HPO4(P=0.0301)和pH(P=0.0066)，其他被考察因素影響不顯著。

2.2 中心組合設計與響應面分析

依據(jù) Plackett-Burman 試驗結果和Box-Behnken 中心組合設計原理，對篩選出的顯著影響麥角甾醇產(chǎn)量的 CuSO4(X1)、K2HPO4(X2)和初始pH(X3)三個關鍵因素進行中心組合設計，3因素取3水平共設計17組試驗，每組試驗重復3次。各因素水平及試驗結果見表2。

利用Design-Expert 7.1.3軟件對中心組合試驗結果進行分析，得到以麥角甾醇產(chǎn)量為響應值(Y)的擬合二次多項式回歸方程：Y=343.64+13.20X1-1.39X2+3.85X3+2.67X1X2-1.04X1X3+9.11X2X3-29.02X12-6.64X22-2.98X32。對回歸方程進行分析，發(fā)現(xiàn)該模型極顯著(P＜0.0001)，多元相關系數(shù)R2=0.9805，說明模型與實際情況擬合很好；在模型參數(shù)中，X1(CuSO4)對麥角甾醇產(chǎn)量的線性效應極顯著(P＜0.0001)，X3(發(fā)酵起始pH)對麥角甾醇產(chǎn)量的線性效應顯著(P=0.0316)，而X2(K2HPO4)對麥角甾醇產(chǎn)量的線性效應不顯著(P=0.3668)。

表1 Plackett-Burman 試驗設計及結果Table 1 Experimental design of Plackett-Burman and corresponding results

表2 中心組合試驗設計及結果Table 2 Results of central composite design

對回歸方程求解，得到各因素的最適水平，即硫酸銅0.07 mmol/L、磷酸氫二鉀1.82 g/L 和pH為6.50，其他因素取Plackett-Burman 試驗中的高水平，在此條件下利用模型預測麥角甾醇產(chǎn)量為348.40 mg/L。

2.3 優(yōu)化結果驗證

為了驗證模型的準確性和有效性，在預測的最佳培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵試驗，試驗重復3次，3次試驗麥角甾醇產(chǎn)量平均值為371.56 mg/L，預測精確度達到93.8%，說明模型可靠。酵母菌麥角甾醇產(chǎn)量比優(yōu)化前(286.89 mg/L)提高了29.5%。

2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵試驗

利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基在5 L 發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵試驗，比較了發(fā)酵過程pH 變化對麥角甾醇產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)pH 控制在6.5左右，麥角甾醇產(chǎn)量達最高，發(fā)酵38 h，細胞生物量為13.33 g/L、細胞麥角甾醇含量為45.15 mg/g、麥角甾醇產(chǎn)量為601.85 mg/L(圖1A)。與搖瓶試驗相比，麥角甾醇產(chǎn)量和轉化率均提高了62.1%。

在分批發(fā)酵試驗基礎上，進行了底物糖蜜流加補料發(fā)酵試驗，發(fā)酵38 h，麥角甾醇產(chǎn)量為1953.85 mg/L，是分批發(fā)酵的3.2倍(圖1B)。其中流加補料發(fā)酵試驗中糖蜜到麥角甾醇的轉化率為10.32 mg/g、麥角甾醇產(chǎn)率為0.28 mg/(g·h)，均比分批發(fā)酵提高了42.7%。

3 結論

圖1 酵母菌在5-L 發(fā)酵罐中批次發(fā)酵和底物流加發(fā)酵時間曲線Fig.1 Fermentation profiles of Saccharomyces cerevisiae in 5 L bioreactor.(A) Batch fermentation.(B) Fed-batch fermentation.

培養(yǎng)基組成是影響發(fā)酵成本和發(fā)酵效率的重要因素，利用廉價可再生的原料是發(fā)酵工業(yè)未來發(fā)展的重要趨勢，本研究以制糖工業(yè)副產(chǎn)物-糖蜜為主原料，綜合采用培養(yǎng)基配方優(yōu)化、發(fā)酵過程pH 恒定控制及底物流加補料策略，不但使麥角甾醇產(chǎn)量比前期報道提高了14.5%，而且生產(chǎn)效率提高了20.5%[11]。與以葡萄糖為主要發(fā)酵原料的研究報道[13]相比，麥角甾醇產(chǎn)量提高了20.2%。本研究為酵母菌發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)麥角甾醇的產(chǎn)業(yè)化應用提供了重要的參考依據(jù)。

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