李倩，趙心清，Jin-Soo Kim，白鳳武

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

2 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622

3 ToolGen, Inc, Seoul, 153-023, South Korea

釀酒酵母的乙醇耐性對(duì)于超高濃度發(fā)酵及連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中保持較高的細(xì)胞活性非常重要。但釀酒酵母乙醇耐性機(jī)制復(fù)雜，與乙醇耐性相關(guān)的基因有 200多個(gè)[1-2]，依靠傳統(tǒng)的單基因操作或局部代謝支路改造很難得到理想的表型，因此本實(shí)驗(yàn)考慮使用人工轉(zhuǎn)錄因子 (鋅指蛋白文庫(kù))[3-4]來(lái)獲得工業(yè)釀酒酵母的高乙醇耐受突變體，并比較其與傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法的正突變率及遺傳穩(wěn)定性等指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

工業(yè)釀酒酵母Sc4126，本實(shí)驗(yàn)室保存。

YPD培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母粉10；固體培養(yǎng)基添加2% (V/V)瓊脂粉。

SD 基本培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 10，不含氨基酸的酵母氮堿 (YNB)6.7。

人工轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)實(shí)驗(yàn)固體和液體培養(yǎng)基分別添加 300 μg/mL 和 100 μg/mL 的 G418。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖100，蛋白胨8，酵母粉6。

所有搖瓶培養(yǎng)條件為30 ℃，150 r/min。平板均在30 ℃下培養(yǎng)2～5 d。

1.2 方法

1.2.1 三種育種方法處理菌體

紫外誘變 (UV)參考文獻(xiàn)[5]處理菌體，選取合適照射時(shí)間使存活率在 50%與 10%左右。等離子體誘變 (Plasma)參考文獻(xiàn)[6]處理菌體，選取合適處理時(shí)間使存活率在 50%和 10%左右。人工轉(zhuǎn)錄因子 (ATF)文庫(kù) 由韓國(guó) ToolGen公司 Jin-Soo Kim教授提供[4]，結(jié)構(gòu)如圖1所示。電轉(zhuǎn)鋅指蛋白文庫(kù)質(zhì)粒到Sc4126中，篩選使用G418。

圖1 人工轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)主要元件Fig. 1 Key elements of the artificial transcription factor library (ATF).

1.2.2 乙醇耐性突變株的篩選和驗(yàn)證

YPD培養(yǎng)基過(guò)夜活化宿主菌Sc4126后添加無(wú)水乙醇使終濃度達(dá)到 20% (V/V)培養(yǎng)不同時(shí)間涂布 YPD平板，選擇無(wú)菌落長(zhǎng)出時(shí)對(duì)應(yīng)的處理時(shí)間T0來(lái)作為耐性篩選條件。

將3種方法得到的突變株用YPD培養(yǎng)基從各自的平板上完全洗下來(lái)，加入無(wú)水乙醇至終濃度20% (V/V)，乙醇沖擊T0時(shí)間后涂布含10%乙醇的YPD平板。

復(fù)篩時(shí)將每種育種方法得到的突變株中菌落最大的挑出，在YPD中過(guò)夜培養(yǎng)后調(diào)整菌株OD600至相同數(shù)值，一方面點(diǎn)滴10% (V/V)乙醇平板和普通 YPD平板，另一方面以20% (V/V)接種量轉(zhuǎn)接到含20% (V/V)乙醇的SD基本培養(yǎng)基沖擊1～5 h計(jì)算存活率，從而定性和定量評(píng)估突變體乙醇耐受性。

1.2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

在每種突變方法獲得的突變株中隨機(jī)選取 15個(gè)突變體，接入 YPD培養(yǎng)基 24 h培養(yǎng)后以 1%(V/V)接種量接至新鮮YPD中，如此傳代10次。將最后一次傳代的菌體與活化培養(yǎng)的元代突變株調(diào)至相同的OD600值，進(jìn)行兩組驗(yàn)證：一組稀釋合適倍數(shù)涂布含10% (V/V)乙醇YPD平板，培養(yǎng)3 d后計(jì)算菌落形成單位 (CFU)；另一組分別接入含8%(V/V)乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36 h后，測(cè)量OD600。如果在兩組實(shí)驗(yàn)中，最后一次傳代的突變株與元代突變株的結(jié)果差異均在40%以上，則認(rèn)為此突變株發(fā)生了回復(fù)突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種改造方法菌體處理?xiàng)l件的確定

確定了乙醇時(shí)間T0為2.5 h。人工轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)使用了兩種效應(yīng)域：激活域 (Gal4轉(zhuǎn)錄因子)和抑制域 (Ume6轉(zhuǎn)錄因子)[4]。根據(jù)兩種物理誘變存活曲線(xiàn)，考慮到過(guò)高的致死率容易導(dǎo)致高比例的負(fù)突變[5]，選擇存活率接近50%和10%的處理時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，即紫外誘變分別選擇45 s和90 s處理，等離子體誘變分別選擇1.5 min和3.5 min。

2.2 三種育種方法效果比較

每種方法出發(fā)菌落數(shù)都在10 000株以上，通過(guò)足夠大的樣本量保證結(jié)果有統(tǒng)計(jì)意義。一般微生物的自發(fā)突變率僅有10-6～10-8[7]，如表1所示，幾種育種方法效率達(dá)到10-4以上，其中人工轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)技術(shù)正突變率更是高達(dá)10-2，比自發(fā)突變率高了至少4個(gè)數(shù)量級(jí)，也高出紫外誘變和等離子體誘變1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。在兩種人工鋅指蛋白文庫(kù)中，鋅指序列后接抑制元件Ume6的突變比率比后接激活域Gal4的高26%，推測(cè)可能原因是與乙醇耐性相關(guān)的天然鋅指蛋白多是通過(guò)抑制靶基因表達(dá)發(fā)揮功能，這與Ume6抑制元件功能相似，因此導(dǎo)入這類(lèi)鋅指蛋白的菌株更易篩選得到乙醇耐性提高的表型[8-9]。

進(jìn)一步對(duì)每種方法得到的菌落直徑最大的突變體進(jìn)行了乙醇耐受的定性與定量測(cè)試。圖2為乙醇平板點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在 10% (V/V)平板上對(duì)照菌只能生長(zhǎng)1～2個(gè)稀釋梯度，而突變株均可以生長(zhǎng)3～4個(gè)稀釋梯度。如圖3所示20% (V/V)乙醇沖擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3種方法獲得的突變株較對(duì)照乙醇耐受性有了顯著提高。以1 h為例，UV誘變、ATF方法和等離子體誘變得到的突變體分別較對(duì)照存活率提高了23.4%、19.1%和14.5%，3種方法均達(dá)到了提高乙醇耐性的目的。

2.3 三種育種方法獲得的突變株遺傳穩(wěn)定性比較

在每組15個(gè)突變株中，紫外誘變組有7個(gè)發(fā)生回復(fù)突變，等離子體誘變組有4個(gè)，而人工轉(zhuǎn)錄因子組只有1個(gè)回復(fù)，遠(yuǎn)低于物理誘變，說(shuō)明人工轉(zhuǎn)錄因子方法得到的突變株較兩種物理誘變方法有遺傳穩(wěn)定的特點(diǎn)。

表1 三種誘變方法效率比較Table 1 Efficiency of three mutagenesis approaches using S. cerevisiae Sc4126

圖2 突變體乙醇耐性的比較Fig. 2 Analysis of ethanol tolerance of mutants on YPD plates (A)and YPD plates with 10% (V/V)ethanol supplement (B).

圖3 紫外誘變 (UV)、等離子體誘變 (Plasma)和人工轉(zhuǎn)錄因子方法 (ATF)篩選到的突變體在 20% (V/V)乙醇沖擊下細(xì)胞存活率曲線(xiàn)Fig. 3 Viability of mutants obtained by UV treatment,plasma mutagenesis and ATF screening under ethanol-shock treatment at the concentration of 20% (V/V).

3 結(jié)論與展望

利用人工轉(zhuǎn)錄因子 (人工鋅指蛋白)文庫(kù)技術(shù)成功獲得200余株乙醇耐性提高的工業(yè)釀酒酵母，正突變率高達(dá)10-2，相比紫外誘變、介質(zhì)阻擋等離子體誘變，具有正突變率高且回復(fù)突變率低的優(yōu)點(diǎn)。人工轉(zhuǎn)錄因子手段還可以進(jìn)行釀酒酵母其他脅迫耐性表型的改造，如耐高溫和高滲等。獲得好的微生物突變體后，可考慮使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)控制效應(yīng)域的轉(zhuǎn)錄，從而控制基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度和表達(dá)時(shí)間，達(dá)到對(duì)生長(zhǎng)和代謝的協(xié)同控制。

致謝：感謝修志龍教授提供介質(zhì)阻擋等離子體設(shè)備；感謝陳慧黠博士對(duì)等離子體誘變部分的實(shí)驗(yàn)給予的幫助和指導(dǎo)；感謝博士生王亮提供的實(shí)驗(yàn)思路和實(shí)驗(yàn)協(xié)助。

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