陳顏亮，鄭治，王劍龍，周曉哲，李艷，楊夢，黃利華，邢曉為

1 中南大學湘雅三醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410013

2 中南大學湘雅三醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，湖南 長沙 410013

精子發(fā)生障礙是引起男性不育的主要原因之一，在精子發(fā)生過程中，生殖細胞先后經(jīng)歷精原細胞有絲分裂階段、精母細胞的減數(shù)分裂階段和精子細胞的變態(tài)成形階段，最后發(fā)育為成熟的精子[1-3]。在精子發(fā)生過程中的每個階段都會有一些特異性的基因發(fā)揮特定作用，維持精子發(fā)生這一重要生殖生理活動[3]。

當前國內(nèi)外的研究認為，Y染色體上的AZF基因微缺失與男性不育有關[4–5]。除了AZF基因外，還有許多常染色體上的基因也參與精子發(fā)生過程[6–7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一個新的包含SUN結(jié)構(gòu)域的蛋白家族參與精子發(fā)生過程。該蛋白家族最為明顯的特征是 C端有一個保守的SUN結(jié)構(gòu)域，靠近N端有跨膜區(qū)(TM)，TM和SUN結(jié)構(gòu)域之間有coiled-coil區(qū)[8-10]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中至少存在5種以上SUN結(jié)構(gòu)域蛋白，已報道的有 SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4 (又稱 SUN4)和 SPAG4L(又稱 SUN5 或TSARG4)等[10]。

在前期研究中，我們從人類精子尾部基因SPAG4出發(fā)，克隆了一個與該基因同處染色體20q11.21區(qū)域的人類睪丸新基因 SPAG4L(或SUN5) (GenBank Accession No. AF401350)[11-13]。通過對不同發(fā)育階段的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L(或稱 SRG4)基因是一個小鼠睪丸特異性表達基因，其表達嚴格受生長發(fā)育調(diào)控[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Spag4L蛋白主要在精母細胞、圓形精子細胞及成熟精子細胞中表達，在精原細胞中不表達[13-15]。通過對 SPAG4L及其突變體的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，SPAG4L在細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜表達，跨膜區(qū) (TM)和 coiled-coil區(qū)對于 SPAG4L在核膜上的定位是必需的[13]。Frohnert等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L在小鼠睪丸中有兩個轉(zhuǎn)錄本，該蛋白在精子中介導核膜和頂體的連接。我們研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L蛋白在分離的小鼠精母細胞中能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志物 PDI和內(nèi)核膜標志物Lamin B1共定位。通過對減數(shù)分裂中Spag4L的表達變化進行觀察，發(fā)現(xiàn)Spag4L 在減數(shù)分裂過程中參與胞核的遷移和核膜重塑[13]。

為了獲得 SPAG4L蛋白，前期研究中我們成功地用PQE-30對SPAG4L的C末端進行了原核表達[16]，該蛋白可用于研究SPAG4L的C端SUN結(jié)構(gòu)域區(qū)的功能，但是不能用于研究N端SPAG4L的功能。SPAG4L是通過N端與核膜上的分子相互作用，從而滯留在核膜上。我們試用了幾種原核表達載體對SPAG4L N端進行表達，均未成功。為了獲得帶有His、Myc 雙標簽的 SPAG4L全長蛋白，本研究從人睪丸cDNA中擴增 SPAG4L開放閱讀框，構(gòu)建到pcDNA3.1/myc-His(-)A 真核表達載體的 CMV啟動子下游，獲得 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L重組質(zhì)粒。隨后，將該重組質(zhì)粒導入到HeLa細胞，經(jīng)G418篩選后，挑取單克隆建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 SPAG4L的細胞系，該細胞系能夠表達帶有 Myc 和 6×His標簽的 SPAG4L蛋白。通過本研究，建立穩(wěn)定表達 SPAG4L全長蛋白的細胞系，將為下一步進行免疫共沉淀和pull-down實驗提供了理想的蛋白，為深入研究SPAG4L蛋白定位在核膜上的分子機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人睪丸cDNA、感受態(tài)細菌JMl09及HeLa細胞由本實驗中心保存；Easy-A高保真PCR擴增酶購自 Agilent公司；SPAG4L抗體購自ABGAB公司(用于免疫熒光)和 Proteintech 公司(用于Western blotting)；PDI 抗體購自Santa Cruz公司；G418購自Amresco公司；限制性內(nèi)切酶購自 Fermentas公司；pcDNA3.1/myc-His(-)A載體購自Invitrogen 公司；His 單克隆抗體、Myc 單克隆抗體、GAPDH 單克隆抗體、FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)、Cy3標記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購自碧云天生物技術(shù)研究所；高糖DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000、胎牛血清購自Gibco公司等。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增SPAG4L基因開放閱讀框

根據(jù)我們提交國際GenBank登錄的序列，用 PCRDESN軟件設計引物，在上游引物中引入酶切位點NheⅠ，在下游引物中引入酶切位點KpnⅠ，并分別在上游和下游引物的5'端加上保護堿基。10 μL PCR擴增體系如下：10×Easy-A反應緩沖液 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各0.1 μL，Easy-A高保真PCR擴增酶0.2 μL，睪丸cDNA模板0.8 μL，加雙蒸水補充至10 μL。在PE9700型PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min 30 s；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后降至4 ℃保溫。擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖電泳進行檢測。

1.2.2 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按照參考文獻[10]所述方法將 PCR擴增的SPAG4L基因片段插入到pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109后，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。所篩選陽性克隆經(jīng)PCR擴增鑒定后抽提質(zhì)粒進行雙酶切，回收目的片段，亞克隆到pcDNA3.1/myc-His(-)A表達載體中。所篩選的克隆經(jīng)PCR鑒定后，抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L細胞系的建立

將消化好的HeLa細胞接種6孔板，每孔接種約1×105個細胞，待細胞融合至80% 左右，按照 LipofectamineTM2000操作說明書提供的方法將 pcDNA3.1/myc-His(-)A 空質(zhì)粒和pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞，24 h后，更換含有G418(800 mg/L)的選擇性培養(yǎng)基進行篩選，每 3天換液一次。篩選35～40 d后，獲得G418抗性細胞克隆。檢測陽性細胞克隆，用有限稀釋法進行亞克隆，用含G418的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察克隆形成情況，待克隆形成后挑單克隆進行擴大培養(yǎng)，檢測SPAG4L的表達，最終獲得單克隆陽性表達SPAG4L的轉(zhuǎn)染細胞系。

1.2.4 Western blotting檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中SPAG4L蛋白的表達

按照RIPA試劑盒說明書所述方法分別提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-His(-)A空質(zhì)粒和pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L的細胞總蛋白，測定濃度，經(jīng)過SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。Western blotting檢測按照常規(guī)方法進行。

1.2.5 免疫熒光技術(shù)檢測SPAG4L表達

在 6孔板底預先放置滅菌好的潔凈蓋玻片,接種細胞，放置到在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，取出后用D-Hanks 液洗脫3次，經(jīng)4 %多聚甲醛固定。參照我們已建立的方法進行免疫熒光實驗，檢測SPAG4L蛋白、標簽Myc,標簽His以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志蛋白PDI的表達[13]。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增SPAG4L基因結(jié)果

PCR擴增 SPAG4L基因開放閱讀框，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)SPAG4L基因擴增條帶大小符合實驗設計。

2.2 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L重組質(zhì)粒的鑒定

挑取轉(zhuǎn)化了 pUCm-T-SPAG4L重組質(zhì)粒的陽性克隆，在含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至合適的濃度，以菌液為模板，PCR擴增SPAG4L基因，篩選陽性克隆。分別將6號和2號陽性克隆抽提質(zhì)粒DNA后測序，將測序正確的6號質(zhì)粒用NheⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收目的基因片段，插入到同樣經(jīng)過 NheⅠ和 KpnⅠ雙酶切的pcDNA3.1/myc-His(-)A表達質(zhì)粒中，篩選陽性克隆，用上述SPAG4L基因引物進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)所挑選的陽性克隆能夠擴增出SPAG4L基因(圖 1)，隨后，抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和KpnⅠ進行雙酶切分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒中所插入的SPAG4L基因片段大小正確(圖 2)。對 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L進行雙向測序，結(jié)果表明，所插入的SPAG4L基因序列沒有發(fā)生點突變和移碼突變，說明重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L構(gòu)建成功。

圖1 PCR鑒定pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L陽性克隆Fig. 1 Positive clones of pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L were identified by PCR. M: 1 kb ladder; 1–5:positive clones; 6: positive control; 7: H2O.

圖2 酶切鑒定pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L重組質(zhì)粒Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L by enzyme digestion.M: 1 kb ladder; 1: pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L plasmid.

2.3 Western blotting檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中SPAG4L蛋白表達

我們將篩選得到的亞克隆進行擴大培養(yǎng)，提取蛋白，應用Western blotting技術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中 SPAG4L及其標簽蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L的細胞系中，帶有Myc和His標簽的SPAG4L蛋白能夠正確表達，蛋白大小在43 kDa左右，蛋白大小與預期相符。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)A的細胞系中，用SPAG4L、Myc、His抗體，均未在43 kDa左右處檢測到目的條帶，而內(nèi)參GAPDH蛋白在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L組和空白質(zhì)粒組均有表達(圖3)。

2.4 免疫熒光檢測結(jié)果

圖3 Western blotting檢測新建細胞系中SPAG4L及其標簽蛋白的表達Fig. 3 Expression of SPAG4L and its tags was detected in stable transfected cell lines. The protein samples were obtained from HeLa cell lines stably transfected with pcDNA3.1/myc-His(-)A (Lane 1)and pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L (Lane 2).

為了觀察 SPAG4L穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中SPAG4L及其標簽蛋白是否表達，應用兔抗人SPAG4L抗體和Myc單克隆(小鼠來源)抗體對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SPAG4L的細胞系進行免疫熒光檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用兔抗人 SPAG4L一抗雜交后，用FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)進行檢測，可見細胞核膜及其周圍出現(xiàn)綠色熒光信號；用Myc單克隆抗體作為一抗進行免疫熒光實驗，用 Cy3標記山羊抗小鼠IgG(H+L)進行檢測，可見細胞核膜及其周圍出現(xiàn)紅色熒光信號(圖4)。由此可見，SPAG4L及其標簽蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中能夠正確表達，即主要分布在細胞核膜及其周圍。

PDI是一種主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，大小為55 kDa的多功能蛋白，其功能是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中催化二硫鍵的形成，促使新生肽鏈成熟成有生物活性的蛋白質(zhì)。本研究中，我們將 PDI作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標志蛋白與 SPAG4L在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SPAG4L的細胞系中進行免疫共定位實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標記為綠色的 SPAG4L蛋白能夠和標記為紅色的PDI蛋白共定位，說明SPAG4L除了在核膜表達，而且還在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達，該結(jié)果與前期本課題組研究的 SPAG4L蛋白亞細胞定位結(jié)果一致(圖 5)。PDI是一個多功能蛋白，SPAG4L是否與PDI相互作用，還有待于進一步研究。

3 討論

精子發(fā)生是一個復雜的過程[1-2]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，SUN 蛋白(SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4和 SPAG4L)是一類新發(fā)現(xiàn)的核膜蛋白，都參與了精子的發(fā)生[9,11,13,17-18]。

圖4 免疫熒光技術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L細胞中SPAG4L和myc蛋白表達Fig. 4 Expression of SPAG4L and myc-tag was detected in stable transfected cell lines by immunofluorescence(200×).

圖5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L的細胞中SPAG4L與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白PDI免疫共定位Fig. 5 SPAG4L colocalized with ER marker PDI by immunofluorescence in cells stably transfected with pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L (400×).

SUN1和SUN2在精子發(fā)生的整個過程中均有表達，將小鼠中Sun1基因敲除，將會導致小鼠出現(xiàn)雄性不育[17]。SUN3是一個睪丸特異性表達蛋白，能夠與Nesprin-1相互作用形成LINC復合物，將分化中的精子核與周圍的細胞骨架結(jié)構(gòu)連接在一起，從而確保精子核能夠正確的成形和延伸，這對于精子頭部的形成至關重要[18]。SPAG4主要在睪丸和胰腺中表達[19]，該蛋白依靠亮氨酸拉鏈與人精子尾部蛋白Odf1相互作用，在精子尾部的形成以及精子運動方面發(fā)揮著重要作用[11]。Kracklauer等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在雄性果蠅中 Spag4對于維持中心粒與細胞核的連接是必需的，如果將 Spag4基因敲除，那么在圓形精子和長形精子中細胞核將不能正確定位，出現(xiàn)核離散的現(xiàn)象，雄性果蠅出現(xiàn)不育。重新將 Spag4基因?qū)?，則生殖功能恢復，其中SUN domain對于生殖功能恢復至關重要。

SPAG4L是我們研究小組首先成功克隆的，生物信息分析結(jié)果表明，SPAG4L與SPAG4雖然同屬SUN蛋白家族，但是它們不是同一個蛋白，它們的氨基酸序列有45% 同源性。Chalmel F等[21]對精子發(fā)生中基因表達變化的研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L基因是一個減數(shù)分裂的標志性基因。我們研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L基因在小鼠出生后3周開始高表達[14]。郭睿等[22]分離純化了小鼠的各級生精細胞，對Spag4L進行了熒光定量PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從粗線期精母細胞階段到長形精子細胞階段Spag4L表達下調(diào)，在圓形和長形精子細胞中其表達量分別下降了33%和45%。這些結(jié)果說明，在小鼠減數(shù)分裂中Spag4L蛋白發(fā)揮著重要的功能。通過對 SPAG4L及其突變體的定位發(fā)現(xiàn)，SPAG4L主要定位于細胞核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。根據(jù)擴散-滯留模型(“Diffusion-Retention” model)理論[10]，從理論上分析，SPAG4L蛋白必須與內(nèi)核膜蛋白或核質(zhì)蛋白相互作用才能保證在核膜上的錨定。

在前期研究中，我們雖然成功對 SPAG4L的 C末端進行了原核表達，但是該融合蛋白不能用于研究SPAG4L的N端功能。生物信息分析結(jié)果表明，SPAG4L C端朝向胞質(zhì)，N端朝向核質(zhì)，靠近N端的地方有跨膜區(qū)，前期研究中，我們嘗試用不同的原核表達載體對 SPAG4L全長進行原核表達，結(jié)果均未成功。因此，我們嘗試將 SPAG4L放到 CMV啟動子下游進行表達，同時，希望所表達的融合蛋白帶有Myc和His雙標簽，以利于后續(xù)的實驗研究。本研究中，我們選擇了真核表達載體 pcDNA3.1/myc-His(-)A，成功構(gòu)建了 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L真核表達質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)染細胞，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，這些細胞系能夠成功表達帶Myc、His標簽的SPAG4L全長蛋白。這樣，我們下一步可以通過6×His標簽對SPAG4L融合蛋白進行純化，通過pull-down實驗研究篩選SPAG4L相互作用蛋白。此外，Myc標簽還可以用于免疫共沉淀實驗，為研究 SPAG4L蛋白相互作用及信號通路提供了有力的工具。

總之，我們成功構(gòu)建了帶有His、Myc雙標簽的 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L真核表達質(zhì)粒，并成功獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L的細胞系，為深入研究SPAG4L蛋白的功能及其相互作用蛋白奠定了基礎。

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